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扩展青霉FS1884脂肪酶基因在毕赤酵母GS115中的表达和定向进化研究

作　者: 李强
导　师: 施碧红
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 扩展青霉 脂肪酶 定点诱变 易错PCR 定向进化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 100次
引　用: 3次
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内容摘要


提取扩展青霉Penieillium expansum FS1884总RNA,RT-PCR扩增获得脂肪酶全长cDNA(858bp),构建表达载体pPIC3.5k-PEL,电转化毕赤酵母GS115中进行异源表达,经甲醇诱导,重组脂肪酶基因在毕赤酵母中成功表达,表达量为0.6mg/ml。NaOH滴定法鉴定重组脂肪酶活力,该重组酶最高比活为2952U/mg,最适作用温度为35℃,最适pH为9.4。根据基因一致性原则选择突变位点,采用一步法对脂肪酶基因进行定点诱变,共选择8个位点进行突变,Leu164Pro,Thr50Cys,Met220Val,Ile102Met,Ile102Val,Ile53His,Arg40Gly,Ser92Ala,经测序验证,8个位点均突变成功。突变体脂肪酶基因经电击转化毕赤酵母后成功表达,其中突变体PEL-M220V-GS相对于野生型脂肪酶比活提高了5%,其余均有不同程度的下降,PEL-L164P-GS,PEL-1102V-GS相对于野生型脂肪酶的耐热性有所提高,PEL-L164P-GS的比活虽然只有野生型重组脂肪酶的47%,但是酶的最适作用温度提高了5℃,为40℃,其余酶的突变体耐热性均有不同程度的下降。利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,得到300株进行复筛,对酶的活力、耐热性、耐酸性进行筛选,最终得到六株较优突变株,摇瓶复筛后获得到突变株ep3,所产突变脂肪酶最适pH为9.4,最适作用温度为35℃,该温度下酶的比活为3440U/mg,比野生型重组脂肪酶高17%。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-7
目录  7-13
绪论  13-31
  第一节 脂肪酶研究概况  13-19
    1.1 脂肪酶的来源  13
    1.2 脂肪酶的结构特点  13-14
    1.3 脂肪酶的分子生物学研究  14-15
    1.4 脂肪酶的催化特点  15-16
    1.5 微生物脂肪酶  16-18
    1.6 微生物脂肪酶的性质  18-19
  第二节 脂肪酶的应用价值  19-21
  第三节 毕赤酵母表达体系简介  21-22
  第四节 定向进化简介  22-27
    4.1 定点诱变  23-24
    4.2 定向进化  24-27
  第五节 本课题研究的目的和意义  27-31
    5.1 目的意义  27-28
    5.2 主要内容  28-31
第一章 扩展青霉FS1884脂肪酶在毕赤酵母GS115中的表达  31-47
  第一节 前言  31
  第二节 材料和方法  31-34
    2.1 菌种和质粒  31
    2.2 试剂及仪器设备  31-32
    2.3 培养基  32-33
    2.4 引物  33-34
  第三节 实验方法  34-39
    3.1 扩展青霉总RNA的提取  34
    3.2 反转录并扩增脂肪酶cDNA  34-35
    3.3 感受态大肠杆菌的制备方法以及转化实验  35
    3.4 SDS碱裂解法制备质粒DNA:小量制备  35-36
    3.5 SDS碱裂解法制备质粒DNA:大量制备  36
    3.6 酵母感受态的制备和转化实验  36-37
    3.7 酵母阳性克隆子的筛选与鉴定  37-38
    3.8 酵母的诱导表达  38
    3.9 SDS-PAGE  38
    3.10 脂肪酶活力的测定方法  38-39
  第四节 结果与讨论  39-45
    4.1 表达载体pPIC3.5k-PEL的构建  39-41
    4.2 转化甲醇型酵母GS115  41-43
    4.3 脂肪酶的诱导表达  43
    4.4 重组脂肪酶的性质鉴定  43-45
  第五节 小结  45-47
第二章 一步法定点诱变扩展青霉脂肪酶  47-75
  第一节 前言  47
  第二节 材料和方法  47
    2.1 菌种和质粒  47
  第三节 试剂及仪器设备  47-50
    3.1 试剂  47-48
    3.2 仪器  48
    3.3 培养基  48-49
    3.4 引物及缩写  49-50
  第四节 实验方法  50-51
    4.1 突变的引物设计  50
    4.2 脂肪酶基因的定点突变  50-51
    4.3 转化毕赤酵母以及诱导表达  51
  第五节 结果与讨论  51-72
    5.1 突变体PEL-L164P-GS  51-55
    5.2 突变体PEL-T50C-GS  55-57
    5.3 突变体PEL-M220V-GS  57-60
    5.4 突变体PEL-I102M-GS  60-63
    5.5 突变体PEL-I102V-GS  63-66
    5.6 突变体PEL-I53H-GS  66-68
    5.7 突变体PEL-R40G-GS  68-70
    5.8 突变体PEL-S92A-GS  70
    5.9 突变体酶的SDS-PAGE分析  70-72
  第六节 小结  72-75
第三章 扩展青霉脂肪酶的定向进化  75-83
  第一节 前言  75
  第二节 材料与方法  75-78
    2.1 菌种和质粒  75
    2.2 试剂及仪器设备  75-76
    2.3 培养基  76-77
    2.4 引物  77-78
  第三节 实验方法  78-79
    3.1 突变体脂肪酶随机突变库的建立  78
    3.2 突变文库的筛选  78-79
  第四节 结果与讨论  79-82
  第五节 小结  82-83
第四章 总结与展望  83-85
附录1 英文缩写意义  85-87
参考文献  87-97
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  97-99
致谢  99-101
个人简历  101

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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