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白地霉脂肪酶基因的异源表达与定向进化

作　者: 赖红星
导　师: 江木兰
学　校: 中国农业科学院
专　业: 微生物学
关键词: 白地霉 脂肪酶 异源表达 定向进化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是分解三酰甘油的水解酶类,还可以催化酯合成、酯交换等反应,它是一类水解三酰甘油生成游离脂肪酸和甘油的界面酶,具有优良的底物特异性和立体选择性。脂肪酶同时具有反应条件温和、副产物少、环境污染小等优点,因此已广泛应用到了食品加工、油脂化工、有机合成与拆分、生物能源、环境治理、医药、造纸、洗涤等行业中。本文对脂肪酶基因启动子的克隆,脂肪酶基因的分泌表达,脂肪酶基因的展示表达以及脂肪酶的定向进化等方面进行了研究。本文共得到以下结果:1利用接头PCR技术分离到一段白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶基因(lip42)的5’侧翼序列,长度为910bp,分析发现其具有真核基因启动子的典型结构特征。2构建了含有白地霉脂肪酶基因成熟肽序列的重组表达载体pET26-lip42,但在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中并没有表达出具有生物活性的脂肪酶,SDS-PAGE发现部分短肽,分析发现这是因为在大肠杆菌中lip42含有稀有密码子所致,使得翻译提前终止。3对产脂肪酶的酵母筛选培养基进行了改良,重组酵母在改良型培养基上既能产生清晰的透明水解圈,又能正常生长。为研究产脂肪酶的重组酵母,特别是脂肪酶的定向进化提供了一种合适的功能筛选培养基。4构建了酿酒酵母重组表达载体pHBM354-lip42,并且实现了在酿酒酵母(Saccharamyces cerevisae)INVScⅠ中的正确表达。用碱滴定法测定脂肪酶酶液的活性,测得初始发酵的脂肪酶活力为0.3U/mL,脂肪酶的比活力为130.58U/mg。5构建了含有lip42前导肽序列的展示表达载体pAMB121-lip42和含有lip42成熟肽序列的展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达,实现了脂肪酶在毕赤酵母细胞表面的展示表达。6建立了一个脂肪酶定向进化的技术平台,主要由体内重组构建突变体库和功能培养基筛选突变体库两步法组成。共筛选到13个脂肪酶活性提高的突变体,测定其中一个突变体(ep3)的比活力为514.98 U/mg,是野生型脂肪酶的近4倍。简言之,本研究使用了大肠杆菌BL21、酿酒酵母INVScⅠ、毕赤酵母GS115三种宿主表达白地霉脂肪酶基因,在酿酒酵母中实现了分泌表达,在毕赤酵母细胞表面实现了展示表达。此外,本研究建立了一个脂肪酶定向进化的技术平台,获得了13个脂肪酶活性提高的突变体,其中一个突变体的比活力提高了近4倍。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章 文献综述  13-44
  1.1 脂肪酶的研究概况  13-26
    1.1.1 脂肪酶简介  13
    1.1.2 脂肪酶的分类  13-15
    1.1.3 脂肪酶的理化性质  15-16
    1.1.4 脂肪酶的生产  16-17
    1.1.5 脂肪酶的催化机制  17-18
    1.1.6 脂肪酶的应用  18-23
    1.1.7 脂肪酶的研究进展  23-26
  1.2 脂肪酶基因的异源表达  26-34
    1.2.1 大肠杆菌表达系统  26-28
    1.2.2 酿酒酵母表达系统  28-31
    1.2.3 毕赤酵母表达系统  31-33
    1.2.4 脂肪酶的异源表达策略  33-34
  1.3 脂肪酶的定向进化  34-41
    1.3.1 定向进化技术简介  34-35
    1.3.2 突变体库的构建  35-38
    1.3.3 突变体库的高通量筛选  38-40
    1.3.4 脂肪酶的定向进化  40-41
  1.4 本课题的研究内容和意义  41-44
    1.4.1 本课题的立题依据  41-42
    1.4.2 本课题的研究思路  42-43
    1.4.3 本课题的研究内容  43
    1.4.4 本课题的目标和意义  43-44
第二章 白地霉脂肪酶基因5’侧翼序列的克隆与分析  44-57
  2.1 引言  44
  2.2 实验材料  44-45
    2.2.1 菌株和质粒  44
    2.2.2 酶和生化试剂  44
    2.2.3 培养基和溶液  44-45
    2.2.4 仪器和设备  45
  2.3 实验方法  45-52
    2.3.1 接头PCR法扩增临近已知序列的未知旁侧序列  45-46
    2.3.2 白地霉的培养  46
    2.3.3 白地霉总DNA的提取  46-47
    2.3.4 白地霉总DNA限制性片段文库的构建  47
    2.3.5 回收限制性酶切片段  47-48
    2.3.6 基因组步移文库的构建  48
    2.3.7 接头PCR法扩增lip42 的5’侧翼序列  48-49
    2.3.8 lip42 5’侧翼序列的TA克隆  49-50
    2.3.9 lip42 5’侧翼序列的序列测定  50
    2.3.10 高保真酶扩增lip42 5’侧翼序列  50-52
  2.4 结果与分析  52-56
    2.4.1 白地霉总DNA的提取  52
    2.4.2 白地霉总DNA限制性片段文库的构建  52-53
    2.4.3 第一轮接头PCR扩增lip42 的5’侧翼序列  53-54
    2.4.4 第二轮接头PCR扩增lip42 的5’侧翼序列  54
    2.4.5 lip42 的5’侧翼序列的序列测定  54-55
    2.4.6 高保真酶扩增lip42 的5’侧翼序列  55
    2.4.7 白地霉脂肪酶基因启动区的生物信息学分析  55-56
  2.5 讨论  56-57
第三章 白地霉脂肪酶基因在大肠杆菌中的异源表达  57-68
  3.1 引言  57
  3.2 实验材料  57-58
    3.2.1 菌株与质粒  57
    3.2.2 酶和试剂  57
    3.2.3 培养基和溶液  57-58
    3.2.4 仪器和设备  58
  3.3 实验方法  58-63
    3.3.1 重组表达载体pET26-lip42 的构建  58-61
    3.3.2 重组表达载体转化表达菌株BL21（DE3）  61
    3.3.3 功能平板检测重组大肠杆菌的脂肪酶活性  61-62
    3.3.4 重组大肠杆菌的诱导表达  62
    3.3.5 SDS-PAGE检测重组脂肪酶的表达情况  62-63
  3.4 结果与分析  63-67
    3.4.1 重组表达载体pET26-lip42 的构建  63-65
    3.4.2 功能平板检测重组大肠杆菌的脂肪酶活性  65-66
    3.4.3 SDS-PAGE检测重组脂肪酶的表达情况  66-67
  3.5 讨论  67-68
第四章 产脂肪酶的酵母筛选培养基的改良  68-75
  4.1 引言  68
  4.2 实验材料  68-70
    4.2.1 菌株与酶液  68
    4.2.2 试剂  68-69
    4.2.3 培养基  69
    4.2.4 仪器设备  69-70
  4.3 实验方法  70
    4.3.1 酵母单菌落的制备  70
    4.3.2 重组酿酒酵母脂肪酶的诱导表达  70
    4.3.3 重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达  70
  4.4 结果与分析  70-74
    4.4.1 重组酿酒酵母的诱导表达  70-72
    4.4.2 重组毕赤酵母的诱导表达  72-74
  4.5 讨论  74-75
第五章 白地霉脂肪酶基因在酿酒酵母中的异源表达  75-88
  5.1 引言  75
  5.2 实验材料  75-76
    5.2.1 菌株与质粒  75
    5.2.2 酶和试剂  75
    5.2.3 培养基和溶液  75-76
    5.2.4 仪器和设备  76
  5.3 实验方法  76-82
    5.3.1 重组表达载体pHBM354-lip42 的构建  76-78
    5.3.2 原始载体与重组载体转化酿酒酵母INVScⅠ  78-79
    5.3.3 功能平板筛选有脂肪酶活性的重组酿酒酵母  79
    5.3.4 重组酿酒酵母的诱导表达  79-80
    5.3.5 脂肪酶酶液的制备  80-81
    5.3.6 Bradford法测定脂肪酶酶液的浓度  81-82
    5.3.7 碱滴定法测定脂肪酶的活性  82
  5.4 结果与分析  82-86
    5.4.1 重组表达载体pHBM354-lip42 的构建  82-84
    5.4.2 原始载体与重组载体转化酿酒酵母INVScⅠ  84
    5.4.3 功能平板筛选重组酿酒酵母  84-85
    5.4.4 重组酿酒酵母的诱导表达与脂肪酶酶液的活性检测  85-86
    5.4.5 Bradford法测定脂肪酶酶液的浓度  86
    5.4.6 碱滴定法测定脂肪酶的活性  86
    5.4.7 脂肪酶酶液的比活力  86
  5.5 讨论  86-88
第六章 白地霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的展示表达  88-102
  6.1 引言  88
  6.2 实验材料  88-89
    6.2.1 菌株与质粒  88
    6.2.2 酶和试剂  88
    6.2.3 培养基和溶液  88-89
    6.2.4 仪器和设备  89
  6.3 实验方法  89-96
    6.3.1 重组展示表达载体pAMB121-lip42 的构建  89-90
    6.3.2 重组展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42 的构建  90-95
    6.3.3 毕赤酵母的转化  95-96
    6.3.4 产脂肪酶的重组酵母的筛选  96
    6.3.5 重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达  96
    6.3.6 重组毕赤酵母脂肪酶活性的测定  96
  6.4 结果与分析  96-100
    6.4.1 重组展示表达载体pAMB121-lip42 的构建  96-97
    6.4.2 重组展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42 的构建  97-99
    6.4.3 毕赤酵母的转化  99
    6.4.4 产脂肪酶的重组酵母的筛选  99-100
    6.4.5 重组毕赤酵母脂肪酶活性的测定  100
  6.5 讨论  100-102
第七章 白地霉脂肪酶的定向进化  102-118
  7.1 引言  102
  7.2 实验材料  102-103
    7.2.1 菌株与质粒  102
    7.2.2 酶和试剂  102
    7.2.3 培养基和溶液  102-103
    7.2.4 仪器和设备  103
  7.3 实验方法  103-108
    7.3.1 突变脂肪酶基因eplip42 的扩增  103-104
    7.3.2 载体pHBM354-lip42 和pHBM354 的大量制备  104-105
    7.3.3 原始载体pHBM354 的双酶切  105
    7.3.4 eplip42 片段和pHBM354 线性片段的共转化  105-106
    7.3.5 功能平板SC-TBT大量筛选突变脂肪酶  106
    7.3.6 突变脂肪酶的诱导表达  106
    7.3.7 突变脂肪酶酶液的制备  106
    7.3.8 突变脂肪酶酶液中蛋白含量的测定  106
    7.3.9 碱滴定法测定突变脂肪酶的活性  106
    7.3.10 突变脂肪酶的生物信息学分析  106-108
  7.4 结果与分析  108-114
    7.4.1 突变脂肪酶基因eplip42 的扩增  108
    7.4.2 载体pHBM354-lip42 和pHBM354 的大量制备  108-109
    7.4.3 原始载体pHBM354 的双酶切  109
    7.4.4 eplip42 和pHBM354 共转化酿酒酵母INVScⅠ  109
    7.4.5 功能平板SC-TBT大量筛选突变脂肪酶  109-112
    7.4.6 突变脂肪酶酶液中蛋白含量及脂肪酶比活力的测定  112
    7.4.7 突变脂肪酶的生物信息学分析  112-114
  7.5 讨论  114-118
    7.5.1 易错PCR中突变的偏好性问题  114
    7.5.2 易错PCR中突变率的控制  114-115
    7.5.3 酵母体内重组法构建脂肪酶突变体库  115-116
    7.5.4 脂肪酶定向进化中筛选方法的改进  116
    7.5.5 突变脂肪酶基因扩增过程中的若干问题  116-117
    7.5.6 突变子的质粒丢失问题  117
    7.5.7 脂肪酶基因的突变与回复突变  117-118
第八章 全文结论  118-120
参考文献  120-127
致谢  127-128
作者简历  128

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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