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玻璃化冷冻诱导卵巢ERS的作用研究

作　者: 丁晓
导　师: 裴秀英
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 遗传学
关键词: 卵巢冻存内质网应激 GRP78 CHOP Caspase-12
分类号: R394
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的通过研究卵巢冻存过程中及FSH干预后内质网应激（ERS）分子伴侣GRP78、凋亡相关蛋白CHOP、caspase-12的表达水平，探讨冻存过程中是否激活了卵巢内ERS，后期卵巢中存在的卵泡丢失是否与ERS途径介导的细胞凋亡相关联，以及FSH对冻存过程中ERS的作用影响。方法领取4周龄ICR雌性小鼠，取其双侧卵巢，剥离外膜后纵向对切成两半，以半卵巢的形式进行培养。首先进行对照组部分建模，包括衣霉素（TM）诱导卵巢ERS模型的建立（包括新鲜对照组、冻存组、TM浓度梯度组：1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml）和牛磺熊去氧胆酸钠（TUDCA）缓解卵巢ERS模型的建立（包括新鲜对照组、TUDCA浓度梯度组：1mM、5mM、10mM）。模型建立后获取卵巢随机分到对照部分：新鲜组、TM组、TM+TUDCA组；实验部分：冻存组、冻存+TUDCA组、冻存+FSH组、保护剂渗透组、保护剂渗透+TUDCA组、保护剂渗透+FSH组中。采用免疫组织化学法检测各分组中内质网应激伴侣分子GRP78、凋亡相关蛋白CHOP、Caspase-12蛋白表达水平，Real-time-PCR技术检测GRP78、CHOP、caspase-12mRNA表达水平。TUNEL法检测各组卵巢内细胞凋亡水平。结果免疫组织化学法检测TM诱导卵巢ERS模型建立各组中GRP78表达水平结果显示：冻存组分别与5-1、20-1、30-1组两两比较有明显统计学差异（P＜0.05）。在TUDCA缓解卵巢ERS模型建立过程中以新鲜组作为阴性对照，以10μg/mLTM诱导组作为阳性对照，将各浓度TUDCA与10μg/mLTM共同作用于小鼠卵巢培养12h，免疫组织化学法检测各组卵巢中GRP78蛋白表达水平结果显示，随着TUDCA浓度的增加，GRP78蛋白表达水平呈现逐渐下降趋势，在TUDCA浓度达到10mM时卵巢内GRP78表达水平及细胞形态基本恢复到新鲜组水平。建模完成后免疫组织化学法检测实验部分冻存组卵巢内GRP78、CHOP及Caspase-12表达水平显示：冻存组ERS伴侣分子GRP78表达水平明显高于新鲜对照组，两组比较有统计学差异（P<0.05）；冻存组ERS凋亡相关蛋白CHOP蛋白表达水平显著高于新鲜对照组，两组对比有统计学意义（P＜0.01)；冻存组内Caspase-12表达低于新鲜对照组；而保护剂渗透组内GRP78、CHOP及Caspase-12蛋白表达水平均高于新鲜对照组。Real-time PCR结果显示：冻存组GRP78、CHOP mRNA表达水平明显高于新鲜对照组，其中CHOP上调幅度更明显，而Caspase-12mRNA表达水平低于新鲜对照组；保护剂渗透组中GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA表达水平较新鲜对照组均有明显上调。保护剂渗透组、冻存组和TM组在添加ERS抑制剂TUDCA后各基因表达水平均有明显下降；FSH干预冻存组后GRP78及Caspase-12表达水平均高于未干预冻存组，CHOP表达水平较冻存组下调；FSH干预保护剂渗透组后GRP78表达水平较未干预时上升，而CHOP及Caspase-12的表达水平则低于未干预组。TUNEL法检测结果显示：冻存组及保护剂渗透组细胞凋亡水平均显著高于新鲜对照组，其中保护剂渗透组细胞凋亡水平高于冻存组，且保护剂渗透组、冻存组、TM组在添加TUDCA及FSH后，细胞凋亡水平均明显降低。结论冻存过程可以诱导卵巢发生ERS，且ERS抑制剂TUDCA对其ERS水平有明显下调作用。其中保护剂渗透组内ERS较剧烈，细胞凋亡主要由ERS引起，FSH干预对由保护剂渗透诱发的内质网应激水平及内质网应激反应介导的细胞凋亡有缓解作用；冻存这一动作对由保护剂渗透诱导的ERS有缓解作用，使得卵巢内细胞并不因ERS走向凋亡，冻存后存在的ERS主要由保护剂渗透这一过程诱导，冻存后细胞凋亡主要由其他通路介导。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
前言  12-16
材料与方法  16-31
结果  31-44
讨论  44-47
全文总结  47-48
参考文献  48-50
综述  50-56
  综述参考文献  54-56
致谢  56-57
攻读硕士研究生期间发表的文章  57-58
个人简历  58

玻璃化冷冻诱导卵巢ERS的作用研究

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