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三种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选、克隆及功能研究

作　者: 滕文君
导　师: 张正光
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 激发子病毒诱导基因沉默过敏性细胞死亡 MADs-box 植物防卫反应
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为了抵抗病原菌的侵染,植物进化出一套可以抑制病原菌扩展的防卫机制,使之能识别特定的病原菌,并作出及时、有效的防卫反应。植物具有两种层面的先天免疫系统：第一种是基于细胞表面的模式识别受体对病原物相关分子模式的识别,即病程相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMP),这种模式诱导的防卫反应称为PTI；第二种是植物细胞内的R蛋白通过对病原菌释放在寄主细胞内的效应分子的识别而触发的免疫防卫反应,称为效应分子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity, ETI)。PAMPs是一类比较保守的微生物物质,可以启动植物体级联信号途径,最终诱发植物的抗病性。本研究采用病毒诱导基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)从本氏烟(Nicotiana benthamiana) cDNA文库中筛选、克隆了参与三种激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的过敏性细胞死亡(Hypersensitive cell death, HCD)的基因,并对其中一个参与调控harpin诱导的过敏性细胞死亡的基因NbMADsl进行机制研究。本研究利用PVX病毒表达载体构建了本氏烟cDNA文库,通过农杆菌Gv3101接种沉默烟草,从2500颗烟草中筛选到16个参与不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的基因和3个沉默后影响烟草生长的基因,通过在网站上比对,其中12个与已知基因有较高的同源性。其中编号为Nb2-37的基因编码烟草中的MADs-box蛋白,我们从本氏烟中克隆了该基因的全长cDNA命名为NbMADsl,该基因的沉默可以减弱harpin诱导的HR; Nb34-22和Nb34-3两个克隆分别编码依赖于ATP的蛋白酶和UDP-D-木糖合酶,两者沉默后均能使烟草矮化；克隆Nb16-5编码ADP-核糖基化因子,该基因沉默后本氏烟死亡。上述结果表明,利用烟草cDNA文库并采用VIGS技术沉默烟草并注射激发子,可筛选并克隆参与不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,并为揭示激发子诱导的植物防卫反应分子机制提供试验依据。从本氏烟cDNA文库中筛选到一个调控激发子诱导的过敏性细胞死亡的基因NbMADS1,通过Nep1、harpin和INF1的注射发现该基因沉默能减弱harpin诱导的HCD,但不影响Nep1和INF1诱导的HCD。NbMADsl基因沉默削弱了激发子harpin诱发的H202积累,抑制了harpin诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子Nep1和INF1诱导的HR、AOS、NO及气孔关闭均没有影响,这表明不同激发子诱导气孔关闭、NO和H202积累的机制存在差异。大量研究表明,MADs-box基因家族参与了植物花器官的分化和下游基因的调控,但至今没有关于该基因家族是否参与植物防卫反应的报道。因此本研究对于探究harpin诱导的HR分子机制和MADs-box基因家族是否参与植物防卫反应具有重要意义。研究表明NbMADsl基因沉默削弱了激发子harpin诱发的H202积累,抑制了harpin诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子Nep1和INF1诱导的HR、AOS和NO积累、气孔关闭均没有影响,通过外源添加H202可以诱导NbMADs1-沉默植株的气孔关闭和保卫细胞内NO的积累,并且外源添加NO提供剂SNP可以诱发NbMADs1沉默植株保卫细胞内H202的积累和气孔关闭。大量研究表明,在本氏烟中,MADs-box基因通过NbMADs1-H2O2-NO参与了harpin诱导的气孔关闭和防卫反应。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-31
  第一章激发子诱导的植物防卫反应及研究进展  11-22
    1 激发子的识别  11-12
      1.1 激发子的受体  11-12
      1.2 激发子无毒性决定簇和R蛋白的互作  12
    2 激发子的信号传导  12-17
      2.1 G蛋白(GTP binding proteins)  12-13
      2.2 蛋白质磷酸化作用  13-15
      2.3 脂类代谢途径  15-16
      2.4 环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)途径  16-17
    3 激发子诱导植物产生的信号分子  17-20
      3.1 激发子诱导的ROS和NO合成  17-19
      3.2 ET、SA和JA信号通路  19-20
    4 激发子的种类  20-22
      4.1 真菌类激发子  20
      4.2 细菌类激发子  20-21
      4.3 非生物来源激发子  21-22
  参考文献  22-31
下篇研究内容  31-81
  第一章三种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选及克隆  33-51
    摘要  33-34
    ABSTRACT  34-36
    1 材料和方法  36-39
      1.1 材料  36-37
      1.2 方法  37-39
    2 结果  39-42
      2.1 验证农杆菌阳性克隆  39
      2.2 激发子诱导的细胞死亡调控基因的筛选  39-40
      2.3 序列比对结果  40-42
      2.4 MADs-box家族氨基酸序列进化树分析  42
    3 讨论  42-45
    参考文献  45-51
  第二章 NbMADs1在激发子诱导的过敏性细胞死亡和气孔关闭中的功能研究  51-81
    摘要  51-52
    ABSTRACT  52-55
    1 材料与方法  55-59
      1.1 材料  55-56
      1.2 方法  56-59
    2 结果与分析  59-69
      2.1 NbMADs1沉默效率验证  59-60
      2.2 NbMADs1参与harpin诱导的HCD  60-62
      2.3 NbMADs1参与harpin诱导的气孔关闭  62-63
      2.4 NbMADs1参与harpin诱导的H_2O_2积累  63-64
      2.5 NbMADs1参与harpin诱导的NO积累  64-66
      2.6 NbMADs1位于H_2O_2和NO诱导的气孔关闭的上游  66-67
      2.7 NbMADs1位于H_2O_2诱导NO产生的上游  67
      2.8 NbMADs1参与harpin诱导的对烟草疫霉的抗性  67-68
      2.9 NbMADs1调控激发子诱导的PR基因表达  68-69
    3 讨论  69-74
      3.1 NbMADs1的沉默抑制harpin诱导的HR和气孔关闭  70-71
      3.2 NO位于NbMADs1介导的H_2O_2积累下游  71-72
      3.3 NbMADs1的沉默抑制了harpin诱导的抗病性  72-74
    参考文献  74-81
附录  81-93
  参考文献  89-93
攻读硕士学位期间发表的研究论文  93-95
致谢  95

三种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的筛选、克隆及功能研究

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