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光皮桦相关基因的克隆、表达及功能初步分析

作　者: 周厚君
导　师: 童再康
学　校: 浙江农林大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 开花光皮桦 LFY MADS-box SBP-box
分类号: S792.15
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 35次
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内容摘要

光皮桦是广泛分布于我国南方的一种材质优良的珍贵用材树种,研究其开花相关基因的功能及分子机制对于了解林木成花机理具有重要意义,同时也能为调控光皮桦花期,选育优良品种提供基础。因此,本研究期望通过开花途径中关键调控因子LEAFY (LFY)、MADS-box和SBP-box基因的克隆,表达及功能的初步分析,为光皮桦的分子育种提供理论依据。本研究采用同源克隆结合RACE的方法分别克隆到光皮桦BlLFY、BlMADS1和BlSPL1基因。BlLFY长1305 bp,编码321个氨基酸,同源性分析显示,BlLFY与板栗及芒果LFY的同源性最高,达88%;BlMADS1存在2种转录本:第1种为1150bp,编码254个氨基酸,为典型的MADS-box蛋白,属于AP1/SQUA亚家族;第2种在3′端多出162 bp,造成移码突变,编码的MADS-box蛋白C端缺失,初步分析可能是由于内含子的可变剪切造成。2个蛋白与欧洲白桦BpMADS4的同源性分别高达99%和95%。BlSPL1全长838 bp,在3′端含有miRNA156结合位点,编码134个氨基酸,与欧洲白桦BpSPL1的同源性最高(99%)。采用实时定量PCR的方法对处于不同发育阶段的光皮桦雄花、雌花、叶以及芽中基因的表达规律进行分析。结果表明,光皮桦BlLFY基因在生殖器官中的表达量高于营养器官,初始雌花序和萌动雄花序中高表达;同一器官不同发育阶段的表达量也不同,幼嫩且处于发育旺盛阶段的表达量相对较高。BlMADS1基因在雌花序中检测不到表达,但在萌动雄花序、芽以及叶中表达量较高,并且随着发育其表达水平会下降。BlSPL1基因在雄花序中相对表达量较低,在初始雌花序、叶芽以及叶中表达量较高。初步分析BlLFY基因参与光皮桦雌花序和雄花序的发育;BlMADS1基因可能与光皮桦雌花序的启动相关,发育无关,且可能参与叶片的发育;BlSPL1基因与光皮桦雌花序和叶片的发育相关。为进一步研究BlLFY、BlMADS1和BlSPL1基因的功能,构建了各基因的过表达载体,并进行了拟南芥的遗传转化。目前,已获得种子,正在进行转基因植株筛选与鉴定,基因的功能有待分析。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 文献综述  8-18
  1.1 ABC模型  8-9
  1.2 LFY基因与MADS-BOX基因  9-14
  1.3 SBP-BOX基因  14-18
2 材料与方法  18-31
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 植物材料  18
    2.1.2 菌株和质粒  18
    2.1.3 酶、载体和生化试剂  18
    2.1.4 PCR引物  18-19
  2.2 实验方法  19-31
    2.2.1 植物组织总RNA的提取及检测  19-20
      2.2.1.1 总RNA的提取  19
      2.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测RNA  19-20
    2.2.2 反转录cDNA第一链的合成  20-21
    2.2.3 植物组织DNA的提取与检测  21-22
      2.2.3.1 DNA提取  21-22
      2.2.3.2 DNA检测  22
    2.2.4 目的基因全长cDNA的分离  22-27
      2.2.4.1 基因BlLFY序列的获得  22-23
      2.2.4.2 基因BlMADS1 和BlSPL1 序列的克隆  23-26
      2.2.4.3 凝胶回收  26
      2.2.4.4 连接反应  26
      2.2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  26
      2.2.4.6 大肠杆菌感受态细胞（T载体）的转化  26-27
      2.2.4.7 质粒DNA的提取  27
      2.2.4.8 质粒DNA的酶切鉴定  27
      2.2.4.9 序列测定  27
      2.2.4.10 序列比较和分析  27
    2.2.5 基因表达分析  27-28
    2.2.6 表达载体的构建和转化农杆菌  28-29
      2.2.6.1 表达载体的构建  28-29
      2.2.6.2 根癌农杆菌EHA105 感受态的制备  29
      2.2.6.3 电击法转化农杆菌  29
      2.2.6.4 农杆菌菌液的保存  29
    2.2.7 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  29-31
      2.2.7.1 拟南芥的无土培养  29-30
      2.2.7.2 浸花法转化拟南芥  30
      2.2.7.3 转基因植株的筛选  30-31
3 结果与分析  31-48
  3.1 光皮桦开花相关基因的克隆与序列分析  31-42
    3.1.1 光皮桦BlLFY基因的克隆与序列分析  31-35
    3.1.2 BlMADS1 基因的克隆与序列分析  35-39
      3.1.2.1 BlMADS1 基因的克隆  35-36
      3.1.2.2 BlMADS1 基因的特征  36-39
    3.1.3 BlSPL1 基因的克隆及序列分析  39-42
  3.2 基因的表达分析  42-45
  3.3 BlLFY、BlMADS1 和 BlSPL1 表达载体构建  45-46
  3.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  46-48
4 讨论  48-54
  4.1 三个开花基因的序列分析  48-50
    4.1.1 光皮桦BlLFY的序列分析  48
    4.1.2 光皮桦BlMADS1 的序列分析  48-49
    4.1.3 光皮桦BlSPL1 的序列分析  49-50
  4.2 基因的表达分析  50-54
    4.2.1 BlLFY基因的表达分析  50
    4.2.2 BlMADS1 基因的表达分析  50-51
    4.2.3 BlSPL1 基因的表达分析  51-54
5 结论  54-55
参考文献  55-62
附录  62-65
致谢  65-66
硕士期间主要研究成果  66

光皮桦相关基因的克隆、表达及功能初步分析

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