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CRACC与NK细胞介导小鼠肝脏损伤研究

作　者: 李扬兮
导　师: 孙汭
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: CRACC NK细胞活化枯否细胞暴发性肝炎 RNA干扰
分类号: R329.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

CD2样细胞毒性细胞活化受体(CD2-like receptor activating cytotoxic cells, CRACC)是属于淋巴细胞活化信号分子(signaling lymphocytes activating molecule, SLAM)家族的免疫调节受体,丰富表达于多种免疫细胞表面,并具有该家族自身受配体识别、和依赖于SLAM相关蛋白(signaling lymphocyte activating molecule-associated protein, SAP)家族接头蛋白的双向调节能力的特点。目前认为CRACC是表达于自然杀伤细胞(natural killer cells, NK cells)、自然杀伤T细胞(natural killer T cells, NKT cells)、活化T细胞、B细胞和成熟树突状细胞(dendritic cells, DCs)表面的一种重要受体,发挥着促进NK细胞杀伤功能、促进B细胞增殖和细胞因子自分泌的能力。同时研究还发现CRACC在自身免疫病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎)、多发性骨髓瘤、进行性牙周炎等多种免疫调控失衡所致的疾病中都表现出异常表达,提示CRACC可能参与促进这些免疫调控失衡所致的炎症和肿瘤的发生。另一方面,近年来越来越多研究认为肝脏是一个天然免疫器官,存在数量众多且种类丰富的天然免疫细胞,并且这些天然免疫细胞相互关联,协调合作,广泛的参与到肝脏组织的感染、炎症、脂肪肝、纤维化、肝硬化、肿瘤、自身免疫肝病和肝脏再生的各种生理病理活动中。免疫细胞之间的相互协调依赖于细胞间受配体识别和细胞因子的相互作用。而SLAM家族受体主要表达在免疫细胞表面,介导免疫细胞间的相互作用,并已有研究证明表达在肝脏NK细胞表面的SLAM家族受体2B4通过识别肝脏肿瘤组织中单核细胞所表达的配体CD48而抑制NK细胞肿瘤杀伤能力,进而导致肿瘤逃逸。我们有理由相信丰富表达于NK细胞表面的活化性受体CRACC对肝脏NK细胞参与肝脏局部环境的免疫反应有着重要的调节作用。在本实验室以往的研究中,已经构建了一个由聚肌胞苷(polyinosinic: polycytidylic acid, PIC)和D-半乳糖胺(D-galactosamine, D-GalN)所诱发,由NK细胞介导的爆发性肝炎模型。在这个肝炎模型中,我们已证明NK细胞通过活化性受体NKG2D和枯否细胞(Kupffer cells)相互识别,促进细胞因子分泌,进而导致严重的肝脏病理损伤。但是研究也发现此模型中介导NK细胞活化的受体不止NKG2D一种；而同时文献中有报道脾脏NK细胞受到PIC刺激活化之后,可以上调CRACC的表达；于是我们推测NK细胞的活化性受体CRACC也可能参与其中,进一步促进肝脏炎症。在我们的研究中,我们比较了CRACC在不同器官来源的多种免疫细胞上的表达分布状况,并观察了PIC刺激对CRACC在各种免疫细胞表面表达的变化情况；我们还通过体内、体外实验对表达在巨噬细胞表面的CRACC进行了特异性RNA干扰,观察CRACC对PIC/D-GalN诱导暴发性肝炎的影响及其机制。经过以上研究我们主要获得以下结果：1. CRACC在肝脏NK细胞上表达丰富我们通过流式细胞术检测了肝脏、脾脏、肺脏、外周血、肠系膜淋巴结和骨髓内NK细胞、NKT细胞、T细胞和B细胞上CRACC的表达分布；经过比较发现,正常情况下,相对于脾脏、外周血等外周组织来源的NK细胞,肝脏NK细胞表达了更高水平的CRACC;同时我们也发现不同淋巴细胞亚群表面CRACC的表达也会有所不同,NK细胞和NKT细胞表达水平较高,而B细胞次之,T细胞最低。接着我们还对肝脏枯否细胞、肺泡巨噬细胞和腹腔巨噬细胞表面表达的CRACC进行了检测,发现肝脏巨噬细胞(枯否细胞)表面低水平表达CRACC,而肺泡巨噬细胞和腹腔巨噬细胞表面表达CRACC的水平更低。通过这些结果我们发现CRACC在肝脏天然免疫相关淋巴细胞(NK细胞、NKT细胞)上优势表达,而也相对高表达于肝脏巨噬细胞表面；提示了CRACC对肝脏天然免疫调节具有重要功能。2.PIC体内注射刺激可以显著提高肝脏NK细胞和枯否细胞上CRACC的表达接着我们使用PIC对小鼠进行了刺激,结果发现小鼠肝脏枯否细胞表面的CRACC表达明显上调,而其分布在其他组织巨噬细胞表面的CRACC并无变化；同时观察也发现小鼠肝脏NK细胞表面表达的CRACC也发生了明显上调,而NKT细胞表面的CRACC表达并没有明显变化。进一步我们在PIC/D-GalN模型中观察了CRACC的表达变化。我们追踪了PIC/D-GalN模型不同时间点肝脏组织中CRACC表达水平的变化,结果发现CRACC在肝组织中的表达升高明显伴随着肝脏病理损伤的发生,提示CRACC表达升高可能会促进PIC/D-GalN诱发的肝损伤。同时我们还通过实验证明了在该模型中D-GalN对CRACC的表达并没有影响。这些结果提示CRACC可能通过促进肝脏NK细胞和枯否细胞之间的相互活化而促进了PIC/D-GalN所诱导的暴发性肝炎。3.特异性干扰下调枯否细胞上CRACC表达可以显著减轻PIC/D-GalN所诱导肝脏急性损伤在实验中,我们发现一种基于阳离子脂质体的纳米颗粒材料可以将siRNA特异性的导入小鼠在体的肝脏枯否细胞。于是我们设计了靶向CRACC的siRNA,使用该技术将包被在纳米颗粒中的siRNA特异性导入小鼠枯否细胞,抑制其CRACC表达；而结果发现当肝脏枯否细胞表面CRACC表达被沉默后,肝脏损伤明显减轻。这些结果证实了CRACC参与促进了PIC/D-GalN诱导NK细胞参与的爆发性肝炎。4.NK细胞和枯否细胞之间的通过CRACC相互识别促进NK细胞激活由于以前的研究已证明PIC/D-GalN介导暴发性肝炎的分子机制是活化的NK细胞和枯否细胞分泌大量IFN-γ和TNF-α,从而对肝组织产生了严重病理损伤。于是我们就想研究CRACC促进肝损伤是否也是通过介导细胞因子分泌而导致。我们通过纳米颗粒包被siRNA对PIC刺激的体外共培养体系中的巨噬细胞表达CRACC进行干扰,结果发现培养体系中的IFN-γ和TNF-α明显减少；进一步使用抗体阻断的方式对共培养体系进行干预,发现PIC刺激后NK细胞所表达的IFN-γ明显下降了。这些结果说明了在PIC/D-GalN介导的暴发性肝炎中,CRACC在肝脏NK细胞和枯否细胞表面上调表达,并介导NK细胞活化,促进了炎性细胞因子分泌,进而加重了肝脏病理损伤。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
目录  11-14
图序  14-16
表序  16-17
符号说明  17-19
第一章绪论  19-51
  1.1. CRACC与SLAM家族  19-42
    1.1.1. 总述  19-36
    1.1.2. CRACC  36-39
    1.1.3. SLAM  39
    1.1.4. 2B4/CD48  39-40
    1.1.5. NTB-A(人)/Ly108(鼠)  40-41
    1.1.6. Ly9  41
    1.1.7. CD84  41
    1.1.8. BLAME & SF2001  41
    1.1.9. 小结  41-42
  1.2. 肝脏免疫损伤  42-49
    1.2.1. 肝脏的免疫解剖学与免疫微环境  42-43
    1.2.2. 肝脏的天然免疫  43-46
    1.2.3. 肝脏天然免疫细胞与肝脏免疫损伤模型  46-48
    1.2.4. SLAM家族分子参与调节肝脏免疫  48
    1.2.5. 小结  48-49
  1.3. 纳米材料包被siRNA给药  49-51
    1.3.1. 纳米材料给药技术  49-50
    1.3.2. 纳米材料包被siRNA靶向枯否细胞给药  50
    1.3.3. 小结  50-51
第二章引言  51-55
第三章材料方法  55-67
  3.1. 实验材料  55-59
    3.1.1. 小鼠  55
    3.1.2. 细胞系  55
    3.1.3. 抗体  55-56
    3.1.4. 生物化学试剂  56
    3.1.5. 纳米颗粒包被siRNA  56-57
    3.1.6. RT-PCR及定量PCR试剂  57
    3.1.7. CRACC表达载体  57
    3.1.8. 细胞培养材料  57-58
    3.1.9. 谷丙转氨酶检测试剂  58
    3.1.10. ELISA检测试剂盒  58
    3.1.11. NK细胞MACS分选试剂盒  58
    3.1.12. 仪器设备  58-59
  3.2. 实验方法  59-67
    3.2.1. 小鼠MNCs的分离  59-60
    3.2.2. 小鼠肝脏NK细胞的分离纯化  60-61
    3.2.3. 小鼠巨噬细胞的分离  61-62
    3.2.4. 小鼠肝细胞分离  62
    3.2.5. 细胞培养及质粒转染  62-63
    3.2.6. 流式细胞术  63
    3.2.7. 小鼠PIC或PIC/D-GalN刺激  63
    3.2.8. 小鼠纳米颗粒包被siRNA给药与体外转染  63
    3.2.9. 抗体阻断实验  63
    3.2.10. RT-PCR与荧光定量PCR  63-65
    3.2.11. 免疫荧光染色与激光共聚焦扫描显微镜成像  65
    3.2.12. 病理切片和H&E染色  65-66
    3.2.13. 小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)检测  66
    3.2.14. 细胞因子ELISA检测  66
    3.2.15. 统计分析  66-67
第四章实验结果  67-85
  4.1. CRACC在肝脏NK细胞上表达丰富  67-69
  4.2. PIC体内注射刺激可以显著提高肝脏NK细胞和枯否细胞上CRACC的表达  69-76
    4.2.1. PIC注射可以有效刺激肝脏枯否细胞细胞上CRACC表达上调  70-71
    4.2.2. PIC注射可以有效刺激肝脏NK细胞上CRACC表达上调  71-73
    4.2.3. 在PIC/D-GalN模型中可以看到CRACC表达上调与肝脏损伤相关  73-76
  4.3. 特异性干扰下调枯否细胞上CRACC表达可以显著减轻PIC/D-GalN所诱导肝脏急性损伤  76-81
  4.4. NK细胞和枯否细胞之间的通过CRACC相互识别促进NK细胞激活  81-85
第五章讨论  85-89
  5.1. CRACC在不同器官的淋巴细胞上表达状态不同的意义  85-86
  5.2. CRACC在巨噬细胞上的表达与功能  86-87
  5.3. CRACC在病毒性肝炎与炎症中的功能探讨  87
  5.4. 其他SLAM分子在肝脏免疫细胞间相互作用的功能探讨  87-88
  5.5. 总结与展望  88-89
参考文献  89-103
致谢  103-105
攻读博士学位期间的主要研究成果  105
  论文发表  105
  会议论文  105
  获得奖励  105

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