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利用单分子力谱研究凝溶胶蛋白的力学性质

作　者: 吕春梅
导　师: 王炜
学　校: 南京大学
专　业: 物理学
关键词: 凝溶胶蛋白单分子力谱金属离子结合快速折叠蛋白流体阻力
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

力在生命活动中起着非常重要的作用,很多的生理过程,比如肌肉收缩,生物膜的融合,细胞的转运,细胞的支撑,组织转运,蛋白转化,蛋白降解,蛋白折叠与解折叠等都涉及到生命系统中各组分之间被动或主动的力的相互作用。然而在单分子的层面上,这些分子与分子之间或分子内部的作用力是非常小的以至于需要人们用精密的仪器来测量和掌控它们。基于原子力显微镜(AFM)的单分子力谱技术(SMFS)的应用大大扩展了人类的研究领域,使得越来越多的研究者从单分子的水平上来探索生物分子的各项性质,为人类带来了一个又一个的惊喜与挑战。在细胞的生命活动中,细胞骨架起着非常重要的作用,它可以支撑细胞膜,使细胞质在凝胶态和溶胶态之间转换。在这一过程中,凝溶胶蛋白(gelsolin)超家族起着重要的调控作用,这些蛋白可以以钙依赖的方式剪切、封盖细胞骨架中的重要组成部分——肌动蛋白纤维或促进肌动蛋白元成核聚集,使肌动蛋白在单体和聚集体形态之间保持动态平衡,从而控制细胞的运动或形变,在这些生理过程中都有力的参与。一般来讲,如果某个蛋白参与调控与力有关的元件,那么这个蛋白本身也会受到力的影响。在本文中,我们利用单分子力谱技术来研究凝溶胶蛋白家族中成员的力学性质。在第一章中,我们对基于原子力显微镜的单分子力谱技术的原理以及凝溶胶蛋白家族蛋白的结构和功能做了简单的背景介绍。在第二章中,我们介绍了力的作用下,凝溶胶蛋白的结构域对金属离子的亲和力增强这一现象,并做出了分析与讨论。一般情况下,力会导致蛋白质天然态构象发生或大或小的改变从而降低其对配体的亲和力。然而在这里我们发现,凝溶胶蛋白的第6个结构域-G6-对钙离子的亲和力会被机械力增强。利用基于原子力显微镜的单分子力谱技术,我们发现G6与钙离子的结合是一个非常快速的过程,而且在外力的作用下G6在解折叠之前对钙离子的结合能力会显著提高。我们的结果表明,在生物体内,如果在凝溶胶蛋白上作用一定的拉力,更低的钙离子浓度就能将其激活。蛋白质与配体的结合能够被外力促进这是一种全新的论证,这有利于我们更好的理解在压力环境下复合物之间的相互作用,在多结构域蛋白中,这种结构域之间的拉力可能是不同的结构域之间协作和交流的普遍机制。在第三章中我们研究了凝溶胶蛋白家族中的另一种蛋白—绒毛蛋白的结构域的力学特性,我们发现这个小结构域具有很低的折叠协作性,并且发现该蛋白在复折叠之前,它已经预先折叠好部分的二级结构所以能够快速复折叠。一些小的蛋白分子比如绒毛蛋白的头盔结构-Hp35可以以很低的折叠协作性在亚微秒时间尺度内折叠。尽管这些蛋白已经被研究得很广泛了,但有关它们折叠机制的探究很是很有限的。在这里我们研究了Hp35在外力作用下的解折叠。我们的结果表明Hp35在很低的力的作用下就可以解折叠并且它的解折叠没有跨过明显的解折叠转变态。然后我们利用从单分子力谱实验中得到的持续长度来刻画解折叠态的Hp35的结构信息。我们发现HHp35的持续长度大约为0.72nm,这比那些典型的解折叠态蛋白的持续长度长约40%,这就表明在解折叠态的Hp35中存在着大量的残留的二级结构。分子动力学模拟进一步证实了这一结论并发现即使将蛋白拉到8nm那么长,在Hp35中很多天然接触仍然是存在的。我们的结果表明在解折叠态Hp35中残留的大量的二级结构有效的降低了蛋白折叠到三级结构所需要的熵变,进而提高了其折叠速度,尽管这是以降低蛋白的折叠协作性为代价的。另外,我们认为我们在本工作中所使用的利用持续长度来反映二级结构的方法可以被扩展用来研究其他具有复杂折叠行为的甚至某些具有无规结构的蛋白。在对蛋白分子进行的单分子实验过程中,为了刻画蛋白的折叠动力学信息,我们需要进行不同拉伸速度下蛋白的解折叠实验。接下来,在第四章中我们发现在很高的拉伸速度下,除了蛋白的解折叠会发生变化以外,溶液中流体阻力的存在会使针尖受到的力产生变化。这是具有很高的生物学意义的。在细胞中有很多的生理过程,比如说生物大分子的扩散,分子马达的运动以及蛋白质分子的折叠动力学会受到流体阻力的影响,这是因为整个细胞中的环境是非常黏稠的。然而,流体阻力与不同溶质分子的物理特性之间有没有什么联系呢?这里我们利用基于原子力显微镜的力谱技术直接测量了在不同的溶质溶液中,作用于一个移动的物体—AFM针尖上的流体阻力的大小。我们发现流体阻力不仅仅和溶液的黏度有关,而且与溶质分子的大小相关。直观的看来,即使溶液中局域性微观黏度下降,流体阻力也是随着溶质分子量的增加而增大的。我们提出了一个模型来解释这一现象。我们的这一发现有利于人们利用单分子力谱来直接测量溶质的分子量,有利于人们从分子水平来理解流体阻力,另外我们的结果对人们理解生物体内分子马达的运动是有帮助的。总之,通过以上的研究我们了解了在力的作用下凝溶胶蛋白及其家族蛋白的一些性质,首次利用单分子力谱技术发现外力可以提高蛋白结构域对金属离子的亲和力；发现一些小蛋白之所以能够快速折叠,是因为在折叠之前,它已经“做好准备”,预先存有部分的二级结构；另外,我们发现在高速力谱拉伸实验中,流体阻力会对移动的针尖产生力的影响,我们定量的分析了溶质分子的分子量与自由针尖所受到的流体阻力的关系,这有利于人们利用流体阻力来分析溶液中溶质的性质,而且对人们理解细胞黏稠环境中物体所受到的力在具有一定程度的启发意义。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-15
缩略词注释  15-17
第一章绪论  17-34
  1.1 基于原子力显微镜的单分子力谱技术原理  17-19
  1.2 对多聚蛋白分子的两种力谱操作模式及其力谱曲线  19-22
  1.3 蛋白质折叠和解折叠的动力学和热力学  22-25
  1.4 蛋白质的机械稳定性是一种动力学稳定性  25-26
  1.5 利用单分子原子力显微镜来描绘蛋白质的自由能能量面  26-27
  1.6 凝溶胶蛋白的生物学作用  27-29
  1.7 凝溶胶蛋白的结构信息  29-32
  1.8 凝溶胶蛋白的活化与力的关系  32-34
第二章利用单分子力谱揭示出力能够促进凝溶胶蛋白对钙离子的结合  34-53
  2.1 引言  34-35
  2.2 实验材料和方法  35-38
  2.3 结果  38-50
  2.4 讨论和结论  50-53
第三章利用单分子力谱和分子动力学模拟研究了Hp35的低折叠协作性  53-73
  3.1 引言  53-54
  3.2 实验材料和方法  54-57
  3.3 结果  57-70
  3.4 讨论  70-72
  3.5 结论  72-73
第四章溶液的黏度和溶质的分子量对流体中阻力的影响  73-83
  4.1 引言  73
  4.2 实验材料和方法  73-74
  4.3 结果和讨论  74-81
  4.4 结论  81-83
第五章结论  83-86
参考文献  86-101
发表论文  101-102
致谢  102-104

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