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阿托伐他汀对单核—内皮细胞黏附的影响及其作用机制的探讨

作　者: 李屹
导　师: 刘惠亮
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 阿托伐他汀 原子力显微镜 细胞间黏附分子-1 单分子力谱
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:利用肿瘤坏死因子-a(TNF-a)诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生脂质过氧化,通过细胞黏附试验观察阿托伐他汀(ATV)干预后脂质过氧化内皮细胞与单核细胞(U937)发生黏附的改变,并分别从ATV对HUVEC表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达量及单分子ICAM-1与其配体CD11b相互作用力的影响两方面进一步探讨ATV调脂外的抗炎作用机制。方法:以0.1% I型胶原酶37℃消化15-20min人脐静脉内皮,分离获得的原代HUVEC用低血清内皮细胞专用培养基培养,37℃、5%CO2孵箱内培养至融合后传代;用VIII因子相关抗原鉴定HUVEC,将第2-3代细胞用于实验。1单核-内皮细胞黏附试验将HUVEC接种于96孔板,分组实验:①.Control(对照组);②TNF-a(TNF-a10ug/L);③.TNF-a+ATV(TNF-α10ug/L+ATV10μmol/l)。(TNF- a 10ug/L孵育24小时后,与ATV共同孵育24小时)。25%Rose Bengal染色法检测HUVEC与单核U937细胞黏附情况,酶标仪570nm波长下测定每孔A值,单核细胞摄取的Rose Bengal染料在PBS-乙醇作用后释放出来,每孔A值与所粘附的单核细胞数量成正比。2 ATV干预对HUVEC表面ICAM-1表达的影响将HUVEC接种至6孔板,分组如上,实验结束收获细胞,将细胞悬液转移入流式管内,PBS洗细胞1次,利用剩余上清液制成细胞悬液(约100ul),每管内加入10ul FITC标记的ICAM-1单克隆抗体,PBS洗细胞3次,流式细胞仪检测每组细胞表面ICAM-1表达,每次记数15000个细胞,结果以平均荧光强度表示。3融合表达载体ICAM-1-GFP的构建及转染COS-7细胞从体外培养的HUVEC中提取总RNA,以pEGFP-N1为模板,设计合成一端含有BamHI酶切位点,另一端将含有HindIII酶切位点的一对PCR引物(上游和下游引物序列如下:ICAM-UPPER: 5’CCA AGC TTC CTC GCT ATG GCT CCC AGC AG 3’;ICAM-LOWER:5’CTG GAT CCA AGG GAG GCG TGG CTT GTG TGT T3’) ,RT-PCR扩增获得ICAM-1 cDNA编码区全长序列,并进行DNA测序。将ICAM-1的骗码区cDNA与pEGFP-N1进行酶切,构建GFP与ICAM-1的C末端连接的表达载体并行双酶切鉴定。构建好的质粒ICAM-1-GFP通过脂质体(lipofectamine2000)介导转染至COS-7细胞,通过激光共聚焦显微镜观察转染后的COS-7细胞是否发出绿色荧光。4 AFM测定ICAM-1与CD11b的单分子力谱AFM探针以标准程序清洁后,室温下于MPTMS孵育2小时将其硅烷化。用一段长约20-40nm的聚乙烯二醇(PEG)作为间隔物,其活性胺基末端和活性巯基末端分别连接人重组CD11b蛋白及AFM探针针尖。将质粒ICAM-1-GFP经脂质体介导转染COS-7细胞,分组测力:①不予任何药物干预(Transfected Cell);②ATV10μmol/l孵育修饰有CD11b蛋白的AFM针尖1小时(Tip+ATV);③ATV10μmol/l孵育转染后的COS-7细胞1小时(ICAM-1-Cell+ATV);④给予抗人ICAM-1单克隆抗体200ug/ml孵育转染后的细胞1小时(ICAM-1-Cell+Anti)。对荧光显微镜下观察各组细胞所获得的ICAM-1荧光融合蛋白聚集区在2.0±0.5×103pN/s的加载速率范围下,令CD11b修饰的AFM探针反复在细胞表面下压-回拉,随机获得力-距离曲线,统计得出针尖和细胞间亲和力的高斯分布及成键几率。结果1 TNF-a诱导组HUVEC与单核U937黏附较对照组明显增多(P<0.05),而ATV干预组的单核-内皮细胞黏附较TNF-a组减少(P<0.05)。2 TNF-a诱导组较对照组HUVEC表面ICAM-1表达量增多(P<0.05),而ATV干预则下调TNF-a诱导的HUVEC表面ICAM-1表达量的增多(P<0.05)。3 DNA测序及双酶切鉴定表明融合表达质粒ICAM-1-GFP的构建成功,且通过激光共聚焦显微镜(×1000)观察ICAM-1绿色荧光融合蛋白定位在COS-7细胞膜表面。4各组AFM测力及成键几率结果分别为:①Transfected Cell:42.04±0.6pN;19.15±4.2%②Tip+ATV:40.04±0.7pN; 20.02±2.6%③ICAM-1-Cell+ATV:39.68±1.3pN; 23.76±2.5%④ICAM-1-Cell+Anti:27.56±0.6pN; 15.70±3.5%。前3组测得ICAM-1与CD11b作用力值及成键几率比较无显著性差异(P>0.05),而第4组与前3组比较力值降低有统计学意义(P<0.05)。结论1 TNF-a诱导的HUVEC发生脂质过氧化增加了其与单核细胞U937发生黏附,而ATV干预有效抑制了TNF-a诱导的细胞黏附的发生。2正常HUVEC膜表面仅有少量ICAM-1表达,应用TNF-a诱导可大幅上调内皮细胞ICAM-1表达,而ATV则有效抑制了ICAM-1表达增加。3 ICAM-1与GFP重组质粒ICAM-1-GFP的成功构建不影响ICAM-1的膜定位及黏附功能,利用AFM测得在静息状态下单分子ICAM-1与CD11b的黏附力大小约为40pN。4 AFM单分子测力结果显示ATV不能通过直接封阻ICAM-1或CD11b而影响其相互作用。非特异针对CD11b和ICAM-1结合位点的ICAM-1单克隆抗体则降低了此作用力值。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-14
英文缩写  14-16
研究论文 阿托伐他汀对单核-内皮细胞黏附的影响及其作用机制的探讨  16-58
  前言  16-18
  材料与方法  18-30
  结果  30-34
  附图  34-46
  附表  46-48
  讨论  48-53
  结论  53-54
  参考文献  54-58
综述 原子力显微镜在生物学领域的应用  58-67
致谢  67-68
个人简历  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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