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应用电致化学发光分子探针技术对微小原甲藻的检测

作　者: 朱霞
导　师: 于志刚；池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 电致化学发光 双特异分子探针 微小原甲藻 赤潮藻
分类号: O657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


赤潮是全球性的海洋生态环境问题,赤潮的暴发严重破坏了海洋生态系统的稳态,并给海水养殖业造成巨大的经济损失。因此,如何有效地对赤潮进行监控及预警是近年来海洋生态学研究领域的一个热点。其中,赤潮藻的鉴定和定量分析是赤潮研究的基础。近年来,以传统显微计数方法为依托,愈来愈多的新技术被应用到该领域并且发挥了愈来愈重要的作用。本研究首先组装一台用于赤潮藻类电致化学发光检测的ECL（electrochemiluminesence）分析仪,通过对其检测条件（工作电压、工作电流、反应试剂浓度和pH、磁珠用量）的反复测试及优化,确定该分析仪具有较高的灵敏度和稳定性。以此为基础,以常见赤潮藻—微小原甲藻（Prorocentrum minimum （Pavillard） Schiller）为研究对象,将TPrA-Ru（bpy）32+电致化学发光分析方法与本实验已建立的双特异分子探针技术（sandwich hybridization integrated with nuclease protection assay, NPA-SH）相融合,成功建立了一种可鉴定到种、分析速度较快的赤潮藻类电致化学发光分子探针检测新技术（electrochemiluminesence-molecular probe, ECL-MP）。该技术将具有种特异性的酶保护分析探针（NPA探针）进行联吡啶钌标记(Ru （bpy）32+ )和生物素（Biotin）标记;经S1酶保护分析后,运用磁性微球分选技术实现对标记探针的快速分离;然后用灵敏度高、分析速度快的TPrA-Ru（bpy）32+电致化学发光分析方法取代NPA-SH中酶标显色分析方法,通过分析光信号强度与藻细胞数目之间的关系建立应用于目标藻定性定量检测的ECL-MP分析曲线。运用该方法对微小原甲藻实验室纯种、混合种、模拟样品以及现场样品进行检测并将结果与显微镜计数结果相比较,二者无显著性差异,证明ECL-MP方法具有良好的特异性和准确度。该方法对微小原甲藻细胞数的线性分析范围为6.25×1024×104个,检测限和检测范围大大优于NPA-SH检测技术（1.1×1043.7×105个）,整个分析过程耗时由NPA-SH技术的近7.5小时缩短为4.5小时。电致化学发光分子探针技术一方面利用了NPA-SH的高特异性,将易于降解的目标生物rRNA转化为等量的互补DNA探针,并利用S1酶降解单链核酸的特性对杂交真实性进行校正,从而实现了对目标藻定性定量检测的目的;另一方面又充分利用了ECL技术灵敏度高和分析速度快的特点,从而简化了操作步骤,缩短了分析时间,提高了检测灵敏度。本研究为赤潮藻的快速准确检测开辟了一条新路。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章 文献综述  11-27
  1.1 赤潮及其危害  11-12
  1.2 赤潮藻种类和数量分析的主要方法  12-20
    1.2.1 基于形态学特征的分析方法  12-13
    1.2.2 基于藻类色素分析的化学分类学方法  13-14
    1.2.3 基于光学特性的浮游藻分析方法  14
    1.2.4 基于免疫分析的检测技术  14-15
    1.2.5 基于核酸分析的检测技术  15-20
  1.3 电致化学发光技术  20-26
    1.3.1 联吡啶钌电致化学发光体系工作原理  21-24
    1.3.2 联吡啶钌标记寡核苷酸在实际检测中的应用  24
    1.3.3 核酸探针在电致化学发光体系中的固定化方法  24-26
  1.4 研究思路  26-27
第二章 电致化学发光检测（ECL）系统的构建  27-36
  2.1 材料与方法  27-30
    2.1.1 试剂与仪器  27
    2.1.2 电致化学发光硬件系统的构建  27-28
    2.1.3 电致化学发光检测系统性能测试  28-29
    2.1.4 联吡啶钌ECL 分析曲线的构建  29
    2.1.5 联吡啶钌ECL 分析曲线的验证  29-30
  2.2 结果与分析  30-34
    2.2.1 电压对ECL 的影响  30
    2.2.2 电流对ECL 的影响  30-31
    2.2.3 TPrA 浓度对ECL 的影响  31
    2.2.4 pH 对电致化学发光检测的影响  31-32
    2.2.5 Ru(bpy)_3~(2+)- ECL 分析曲线的建立  32-33
    2.2.6 Ru(bpy)_3~(2+)- ECL 分析曲线的验证  33-34
  2.3 讨论  34
  2.4 小结  34-36
第三章 微小原甲藻电致化学发光分子探针检测技术（ECL-MP）的建立  36-57
  3.1 材料与方法  37-48
    3.1.1 试剂与仪器  37-39
    3.1.2 藻种培养  39-40
    3.1.3 目标藻RNA 的提取  40
    3.1.4 引物设计及PCR 扩增  40-41
    3.1.5 DNA 纯化、克隆和测序  41-42
    3.1.6 NPA 探针设计及验证  42-43
    3.1.7 联吡啶钌标记NPA 探针的制备和验证  43-45
    3.1.8 磁性微球用量对ECL 的影响  45-46
    3.1.9 微小原甲藻ECL-MP 检测技术的建立及验证  46-48
  3.2 结果与分析  48-54
    3.2.1 NPA 探针特异性验证  48-49
    3.2.2 B-NPA-Ru 探针夹心杂交验证  49
    3.2.3 B-NPA-Ru 探针S1 酶保护分析验证  49-50
    3.2.4 磁性微球用量对ECL 反应的影响  50-51
    3.2.5 微小原甲藻ECL-MP 分析曲线的建立  51-52
    3.2.6 微小原甲藻ECL-MP 分析曲线的验证  52-54
  3.3 讨论  54-55
  3.4 小结  55-57
总结与展望  57-59
参考文献  59-70
致谢  70-71
个人简历  71
发表论文及申请的专利  71

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法（物理及物理化学分析法） > 光化学分析法（光谱分析法）
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