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当各种外源性与内源性因子引起机体组织和细胞损伤性变化时,机体的局部和全身也发生着一系列复杂的反应,以局限和消灭损伤因子,消除和吸收坏死组织,并修复损伤,这种复杂的以防御为主的反应称为炎症反应。因此任何疾病的发生都伴随着炎症反应,包括感染、创伤、失血等各种急性和慢性疾病。然而,当炎症反应在初期未能得到及时有效的治疗时,随后机体产生的多种炎性介质即可形成“瀑布效应”,使炎性反应扩大,甚至失去控制,导致全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SRIS)的形成,进而发展为多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS),甚至死亡。因此,早期抑制炎症反应,对于控制疾病的进展,防止其进一步恶化发挥着重要的作用。经过几十年的研究,当炎症反应启动时,机体发生的生理变化已经明确,包括血管渗透性增高、血液流变学改变、白细胞与血小板黏附、红细胞聚集、实质细胞死亡等。80年代,白细胞黏附和氧自由基的形成被认为是炎症反应中重要的一部分。但是,实施清除氧自由基、抑制白细胞黏附等干预手段,对于抑制炎症反应的效果却十分有限。于是科学家们不断探索,究竟是什么机制触发了炎症反应,导致炎症反应在短时间内迅速发展为SRIS和MODS呢?肠道的作用在多器官功能衰竭的发病机制中一直占有重要位置。1986年Meckins和Marshall首先提出肠道是发生MODS的原动力。90年代,Chang TW研究也证明肠道组织在失血性休克中的重要作用。在实验前切除大鼠全部小肠和部分大肠组织,可明显提高休克复苏后大鼠的存活率。但是,Chang TW并没有阐述在休克发生时,切除肠道组织在减轻机体损害方面的作用机制。近年来的研究进一步表明,肠道作为体内最大的“储菌库”和“内毒素库”,凭借其在体内独特的生理环境,参与了SIRS和MODS的病理生理过程。很多学者提出了肠道细菌/内毒素易位学说,认为在创伤、休克、应激等情况下,由于肠道缺血、肠上皮细胞损害,导致肠黏膜屏障功能受损,肠道内细菌和内毒素易位,为炎性反应提供了丰富的刺激物质,导致炎性反应的持续发展进而引起SIRS及MODS。但是,随着研究的深入,越来越多的研究结果与肠道细菌/内毒素易位学说相矛盾。Koh研究显示,仅在动物淋巴结及输入淋巴管中培养出细菌,而在输出淋巴管中未能培养出细菌。临床试验也证明,选择性肠道去污或抗内毒素治疗法不能有效提高生存率。那么是否还存在其他机制,引发了休克发生时所伴随的高水平的炎症反应呢?近些年,美国Geert W. Schmid-Schonbein的研究认为,肠道内的蛋白酶引起肠壁组织的分解,产生活性因子,是创伤、休克等重症时引发全身炎症反应综合症,进而发展为多器官功能衰竭,甚至死亡的关键因素,即“自身消化”理论。当机体受到各种损害因子侵犯时,肠道黏膜受损,屏障作用减弱,胰腺消化酶进入黏膜下层,甚至肌层,引起肠壁组织的自身消化。由此产生各种活性因子,激活炎症细胞,释放炎症介质,引起机体一系列炎性反应。这些活性因子和炎症介质可通过肠壁淋巴循环和门静脉循环进入全身循环系统,也可直接渗透进入腹腔,引起远隔组织和器官的损害。研究显示,在肠道缺血再灌注大鼠模型中,提前通过肠道内灌注丝氨酸蛋白酶抑制剂加贝酯或耐莫司他的实验组大鼠,再灌注后大鼠的存活率明显提高；检测血浆活性水平,与对照组相比,实验组大鼠血浆活性水平也明显减低,炎症反应减弱。失血性休克发生时,也伴随着高水平的炎症反应,若不能及时抑制,可最终引起多器官功能衰竭,导致死亡。乌司他丁是临床上常用的蛋白酶抑制剂,通过静脉使用,其在治疗急性胰腺炎、抗休克治疗、体外循环心脏手术等方面的治疗效果已经得到肯定。但是,尚没有关于肠道内使用乌司他丁的相关研究报道。因此,本实验在建立失血性休克大鼠模型的基础上,通过肠道内给予蛋白酶抑制剂乌司他丁,探讨是否能够抑制肠道内蛋白酶的自身消化作用,抑制炎症反应,对失血性休克起到一定治疗作用。为失血性休克的治疗提供新的思路与方法。材料与方法1、动物及分组28只健康清洁级wistar大鼠,雌雄不限,体重220-270g。随机分成四组：未灌注肠道组、盐水灌注肠道组、乌司他丁灌注肠道组和乌司他丁静脉组(见表1),每组7只。术前二十四小时正常饮食、饮水。表1.不同组别大鼠干预方式和给药途径表注：NS为0.9%NaCl溶液2、失血性休克模型的制备健康wistar大鼠,以3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后,称取大鼠体重。将大鼠仰卧位固定于实验手术板上,备皮、消毒,进行右侧股动脉、股静脉游离术。游离好动、静脉后,以24号套管针分别行股动脉、股静脉置管,以丝线结扎固定。插管后,立即注入0.3ml肝素生理盐水(含肝素300U)。股动脉套管经三通阀与动脉套装相连,然后连接于血压监护仪,监测平均动脉压变化。股静脉套管与三通阀和2ml注射器相连,用于静脉给药。置管术完成后,于上腹部正中备皮、消毒,打开腹腔。分别于十二指肠上端、回肠末端插入软管,以丝线结扎固定,用于肠道灌洗。以上操作完成后,除未灌注肠道组,其余三组分别将50ml 37℃生理盐水通过输液泵经十二指肠上端管道恒压恒速灌入肠道,最后经回肠末端将肠内容物冲出。灌洗结束后,各组大鼠均经股动脉放血(30min内完成)至平均动脉压40±5 mm Hg,并间断回输或放血维持此血压。休克模型制作成功后,乌司他丁灌注肠道组肠道内给予乌司他丁(50 000U/Kg)盐溶液10ml,静脉给予生理盐水0.5ml；乌司他丁静脉组静脉给予乌司他丁(50 000U/Kg)盐溶液0.5ml,肠道给予生理盐水10ml；盐水灌注肠道组分别通过肠道和静脉给予生理盐水10ml、0.5ml；未灌注肠道组仅静脉给予生理盐水0.5ml。3、检测指标3.1休克前后平均动脉压变化通过心电监护仪观察并记录大鼠休克前后平均动脉压的变化。记录时间点分别为：插管后、灌注开始、灌注10mmin、灌注结束、休克、休克30min、60min、90min、120min和180min,共10个时间点。3.2生存时间通过观察平均动脉压的变化,记录从休克模型制作成功后到大鼠死亡的时间。当大鼠心脏停止跳动,未经处理5min没有变化,确定为死亡3.3血浆活性因子诱导人中性粒细胞黏附分子CD11b的表达将休克后大鼠血浆与健康人全血混合培养,血浆中的活性因子可激活人中性粒细胞,促使细胞表面CD11b的表达增加。通过流式细胞术检测中性粒细胞表面CD11b的表达变化。在休克前、休克120min和180min分别取动脉血0.5ml,含肝素10u/ml。其中20μl用于白细胞计数,剩余全血离心500g,5min,取上层血浆-80℃保存备检。取健康志愿者全血25ml,将50μl老鼠血浆与200μl健康志愿者全血混合,再加入DMEM培养基200μl,混匀后放入37℃培养箱孵育4小时。孵育结束后,取出加入FITC标记的抗人中性粒细胞CD11b单克隆抗体,轻轻震荡混匀后于黑暗处置于冰上45min。用红细胞裂解机裂解红细胞,PBS缓冲液洗涤白细胞三次,最后将标本放入流式细胞仪中,检测CD11b的表达。FITC结合的同种人的IgGl抗体作为非特异性抗体结合的同种对照,数据用百分数表示。3.4白细胞计数采用手工计数法计量休克前、休克120min和180min时外周血白细胞数目。将冰醋酸2ml加入到98ml蒸馏水中,再加入10g/L亚甲蓝溶液3滴,混匀过滤后制成白细胞稀释液。取稀释液0.38ml于试管中,加入大鼠全血标本20μl混匀。滴少量于血球计数板上,充池、静置2-3min后在光学显微镜下计数。3.5肠道黏膜病理变化老鼠死亡后,在距屈氏韧带5cm处取空肠组织约4cm,用0.9%生理盐水反复冲洗4次,取中间2cm组织4%甲醛固定。经脱水、浸蜡、包埋、切片、染色后制成病理切片,在光学显微镜下观察比较不同处理组大鼠肠道黏膜的病理变化。4、统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料以x±s表示。采用重复测量数据的方差分析和完全随机设计多样本比较的方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、休克前后平均动脉压变化采用重复测量数据的方差分析,比较休克前四个时间点组间、组内差异。结果显示：不同处理组的组间效应,F=0.904(P-0.454,>0.05),说明不同处理组休克前血压变化无统计学差异；组内不同时间点比较,F=1.174(P=0.322,>0.05),说明休克前不同时间点血压变化无统计学差异。比较休克后各组大鼠组间差异,F=5.814(P=0.006,<0.05),说明经不同处理后,休克后大鼠血压变化有统计学差异。乌司他丁灌注肠道组与盐水灌注肠道组比较,血压明显升高,有统计学差异(P=0.004,<0.05)；乌司他丁静脉组与盐水组比较,血压也升高,具有统计学差异(P=0.049,<0.05)。但乌司他丁肠道组和静脉组比较(P=0.224,>0.05),盐水灌注肠道组和未灌注肠道组比较(P=0.544,>0.05),差异均无统计学意义。2、生存时间比较采用完全随机设计多样本比较的方差分析,比较不同处理组大鼠生存时间。结果显示：乌司他丁灌注肠道组与未灌注肠道组比较,生存时间延长,有统计学差异(P=0.008,<0.05)；与盐水灌注组比较,生存时间延长,有统计学差异(P=0.013,<0.05)；与乌司他丁静脉组比较,生存时间也延长,具有统计学差异(P=0.039,<0.05)。但是,乌司他丁静脉组与盐水灌注组、未灌注组比较,无统计学差异(P>0.05)。3、血浆活性因子诱导人中性粒细胞黏附分子CD11表达(1)比较休克前各组大鼠血浆激活人中性粒细胞CD11表达,F=0.147(P=0.930,>0.05),说明休克前各组大鼠血浆活性无统计学差异。(2)比较休克120min时各组大鼠血浆激活人中性粒细胞CD11b的表达：乌司他丁灌注肠道组与未灌注肠道组比较,CDllb的表达降低,具有统计学差异(P=0.001,<0.05)；与盐水灌注组比较,CDllb的表达降低,具有统计学差异(P=0.004,<0.05)；与乌司他丁静脉组比较,表达也降低,具有统计学差异(P=0.004,<0.05)。乌司他丁静脉组与盐水组比较,差异无统计学意义(P=1.000,>0.05)。(3)比较休克180min时各组大鼠血浆激活人中性粒细胞CDllb的表达：乌司他丁灌注肠道组与未灌注肠道组比较,CDllb的表达降低,具有统计学差异(P=0.040,<0.05)；与盐水灌注组比较,CD11b的表达降低,具有统计学差异(P=0.048,<0.05)；与乌司他丁静脉组比较,表达也降低,具有统计学差异(P=0.033,<0.05)。乌司他丁静脉组与盐水组比较,差异无统计学意义(P=0.962,>0.05)。4、外周血白细胞数目(1)比较休克前各处理组大鼠外周血白细胞数目：F=0.508(P=0.681,>0.05),说明休克前各组大鼠外周血白细胞数目无统计学差异。(2)比较休克120min时各处理组大鼠外周血白细胞数目：乌司他丁灌注肠道组与未灌注肠道组比较,白细胞数目升高,具有统计学差异(P<0.001)；与盐水灌注肠道组比较,白细胞数目升高,具有统计学差异(P<0.001)；与乌司他丁静脉组比较,白细胞数目也升高,具有统计学差异(P<0.001)。乌司他丁静脉组与盐水灌注组比较,无统计学差异(P=0.767,>0.05)。(3)比较休克180min时各处理组大鼠外周血白细胞数目：乌司他丁灌注肠道组与未灌注肠道组比较,白细胞数目升高,具有统计学差异(P<0.001)；与盐水灌注肠道组比较,白细胞数目升高,具有统计学差异(P=0.001,<0.05)；与乌司他丁静脉组比较,白细胞数目也升高,具有统计学差异(P=0.001,<0.05)。乌司他丁静脉组与盐水组比较,差异无统计学意义(P=0.787,>0.05)。5、肠道黏膜病理变化未灌注肠道组大鼠小肠黏膜固有层充血明显,伴有大量炎性细胞浸润。肠绒毛数量减少,部分变短变粗,形态不规则,甚至出现绒毛断裂现象,肠腔内可见大小不等的绒毛碎片。上皮细胞排列紊乱,形态大小不一,可见细胞变性、坏死等。盐水灌注肠道组和乌司他丁静脉组肠道黏膜损害程度较未灌注肠道组略有减轻。乌司他丁灌注肠道组损害程度最轻。结论：1、肠道内灌注乌司他丁可以延缓失血性休克大鼠休克后血压下降过程,最终延长存活时间。2、乌司他丁作为蛋白酶抑制剂,通过肠道内灌注后,可以减弱失血性休克大鼠血浆炎症反应水平,改善休克后外周血白细胞数目的降低。3、通过肠道灌洗和肠道内灌注乌司他丁对肠道黏膜具有一定保护作用,减轻了休克时肠道黏膜的损害。
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