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DGGE技术在人参重茬地土壤微生物多样性分析中的应用研究

作　者: 金海林
导　师: 金东淳
学　校: 延边大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 人参土壤微生物 DNA PCR-DGGE 多样性研究
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人参(Panax ginseng C. A. Mey.)是忌连作性极强的植物,虽然人参已有1700多年栽培历史,但连作导致人参植株长势减弱,产量、品质和抗病能力明显降低的特性并未发生根本性改变。多年来,国内外许多学者从不同角度对人参重茬障碍机制进行了广泛、深入的研究,并将人参重茬障碍归结于土壤理化性状恶化、营养失衡、土壤有益微生物和有益酶类减少等因素。本文从人参重茬地土壤微生物角度入手,采集三年生、四年生、未种参的重茬地和一年生人参初种地土壤的不同时期、不同生长季节土壤样品,利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳分析技术(PCR-DGGE)对其微生物多样性进行分析和研究,其结果如下：1、对三种土壤微生物基因组DNA的提取方法进行比较分析结果,方法一和方法二提取的DNA虽然提取总量较大,但方法一提取的DNA浓度非常低；方法二提取的DNA纯度低且存在抑制剂(腐殖酸、色素等)的成分,PCR扩增看不见谱带,无法进行后续研究；方法三可提取高纯度的DNA,且可以进行PCR扩增,适合后续研究。方法三和方法一、二的主要区别就是增加了纯化过程,足以证明手工提取方法(SDS)存在着提取DNA纯度不够的缺陷,手工提取方法获得的DNA必须加以纯化,以便于后续研究。试剂盒法提取的土壤微生物DNA纯度较高,且有利于后续PCR扩增,为最优选择。2、对嵌套式聚合酶链式(PCR)反应体系和条件进行优化结果,第一套PCR扩增,用细菌的通用引物Primer A和Primer B扩增全长16S rDNA;第二套PCR扩增,以第一套扩增产物为模板,引物用Primer C和Primer D扩增16S rDNA特异区；reconditioning PCR,把第二套PCR产物稀释为原浓度的1/10做为模板,引物采用Primer C和Primer D,除去第二套PCR扩增中的异二聚体。通过琼脂糖电泳检测,可以得到符合后续实验要求的理想谱带。3、对变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)中的各项条件参数进行优化结果,电泳温度为60℃;电泳第一阶段60V,1h；第二阶段100V,18h；浓度梯度范围在40%-60%范围内,在染色液中染色1h。通过琼脂糖电泳检测,可以得到较为清晰的理想谱带。4、对三年生、四年生及未种参的重茬地土壤和一年生人参初种地土壤样品,进行PCR-DGGE分析结果,三年生、四年生及未种参的重茬地土壤和一年生人参初种地土壤样品间微生物(细菌)种类存在较大差异。所有土样共有菌群为,条带B (Ensifer adhaerens相似率98%)、条带D (Sphingomonas sp. J52相似率95%)、条带F(Acinetobacter sp.相似率97%)、条带H (Uncul tured alpha proteobacterium clone 651相似率97%)、条带I (Stenotrophomonas maltophilia partial相似率82%)、条带K (Gordonia sp. F867相似率85%)。三年生人参重茬地特异性菌群为,条带E (Uncultured Comamonadaceae bacterium相似率93%)、条带G (Curvibacter lanceolatus strain JPPB B27相似率86%)、条带J (Uncultured Shewanella sp相似率95%)；四年生人参重茬地特异性菌群为,条带A (Uncultured Brucellaceae bacterium相似率98%)、条带N (Rhodoferax sp. IMCC1723相似率97%)；未种参重茬地特异性菌群为,条带C (Sinorhizobium sp. B69sp相似率97%)、条带L (Propion ibacterium sp相似率92%)、条带M (Uncultured Raoultella sp.相似率89%)。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
目录  10-12
第一章前言  12-21
  1.1 人参概述  12-13
  1.2 人参重茬障碍  13-15
  1.3 根际土壤微生物研究进展  15-16
  1.4 土壤微生物多样性的相关研究  16-17
  1.5 PCR-DGGE技术在土壤微生物方面的应用  17-20
    1.5.1 PCR—DGGE概述  17-18
    1.5.2 PCR—DGGE技术的特点  18-19
    1.5.3 PCR—DGGE技术相关应用  19-20
      1.5.3.1 用于群落多样性分析  19-20
      1.5.3.2 用于群落动态的分析  20
    1.5.4 PCR-DGGE技术的应用前景  20
  1.6 研究目的及意义  20-21
第二章土壤微生物基因组DNA提取方法比较  21-27
  2.1 实验材料  21
  2.2 主要试剂及仪器  21-22
  2.3 实验方法  22-24
    2.3.1 土壤样品处理  22
    2.3.2 基因组DNA提取  22-24
    2.3.3 DNA纯度检测  24
    2.3.4 PCR扩增  24
  2.4 结果与分析  24-27
    2.4.1 基因组DNA提取结果  24
    2.4.2 三种提取方法的DNA电泳检测结果  24-25
    2.4.3 DNA纯度检测结果  25-26
    2.4.4 PCR扩增结果  26-27
第三章 PCR-DGGE体系优化  27-35
  3.1 PCR体系优化  27-31
    3.1.1 实验材料  27
    3.1.2 主要试剂及仪器  27
    3.1.3 实验方法  27-29
      3.1.3.1 DNA提取  27
      3.1.3.2 DNA样品纯化  27-28
      3.1.3.3 PCR体系优化  28-29
    3.1.4 结果与分析  29-31
      3.1.4.1 模板浓度筛选  29
      3.1.4.2 引物浓度筛选  29
      3.1.4.3 dNTP浓度筛选  29
      3.1.4.4 Taq DNA聚合酶浓度筛选  29-31
  3.2 DGGE条件优化  31-35
    3.2.1 实验材料  31
    3.2.2 主要试剂配制  31-32
    3.2.3 实验方法  32-33
    3.2.4 DGGE条件优化的结果与分析  33-35
第四章人参重茬地土壤微生物多样性分析  35-58
  4.1 实验材料  35
  4.2 实验方法  35-37
    4.2.1 DNA提取及纯化  35
    4.2.2 PCR扩增  35-36
    4.2.3 DGGE分析  36-37
  4.3 结果与分析  37-58
    4.3.1 DNA提取  37
    4.3.2 PCR扩增  37-39
    4.3.3 DGGE结果分析  39-58
第五章讨论  58-60
第六章结论  60-61
参考文献  61-64
攻读学位期间发表的学术论文  64-65
致谢  65

DGGE技术在人参重茬地土壤微生物多样性分析中的应用研究

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