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水稻白叶枯病抗性突变体的筛选与高分辨率溶解曲线在水稻中的应用

作　者: 李锦山
导　师: 陈剑平
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻白叶枯病 T-DNA 突变体高分辨率溶解曲线基因分型
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻白叶枯病是水稻重要病害之一,对水稻生产造成了严重的危害。新的白叶枯病抗性种质资源的获得对于水稻抗白叶枯病育种具有重要意义。本研究对5万个T-DNA 突变体株系进行了系统的大田筛选。从5叶期开始,每个株系经过4轮的白叶枯病菌P10接种,研究初筛获得了一些白叶枯病抗性植株,对其中2个表型较好的植株进行了初步的生理研究。同时,在突变体库中观察获得了一些其他表型突变的株系。为加快水稻突变体基因定位,本研究尝试利用高分辨率溶解曲线技术(high resolution melting, HRM)进行水稻F2群体基因分型,为后期将HRM用于突变体中抗性基因定位探索条件。目前,已取得的主要研究结果有：1.通过T-DNA突变体库大田种植观察及接种P10菌株,初筛获得了125个M0代白叶枯病抗性突变体。同时,获得了一些具有其他表型变化的突变体株系,如类病变突变体,叶色突变体,颖花退化,穗颈长度变化,有芒与无芒,颖壳变化,高矮秆突变,叶形突变等。2.对初筛获得的125个M0代白叶枯病抗性突变体中的17个株系的M1代进行了对P10菌株的抗性鉴定,结果表明2个株系BBM14和BBM66的M1代对P10菌株抗性稳定,且BBM14和BBM66的M1代植株无明显抗性分离。同时,转基因PCR检测表明T-DNA插入已经纯合,因此,需要设计专门实验来判断BBM14和BBM66的抗性是否由T-DNA插入引起。对接种P10后叶片内部的菌株生长情况进行生长曲线分析表明,P10菌株在BBM14和BBM66中的生长相对于亲本中花11明显受到抑制,由此进一步证实了BBM14和BBM66对P10菌株的抗性。对BBM14和BBM66的抗谱分析发现,BBM14对白叶枯病菌株菲律宾生理小种P2 (PXO86), P3 (PXO79), P7 (PXO145), P8(PXO280), P10 (PXO124)表现抗性,对P4 (PXO71), P6(PXO99)表现感病。BBM66对P2,P7,P8,P10菌株表现出抗性,对P3,P4,P6表现感病。同时,将BBM14和BBM66抗谱与已知白叶枯病抗性基因抗谱比较后发现,两者的抗谱与这些白叶枯病抗性基因抗谱都不同,因此,初步判断BBM14和BBM66中均具有新的白叶枯病抗性基因。对BBM14和BBM66中的部分防卫相关基因进行表达分析,结果表明接种P10菌株后OsPRlb基因表达上调。3.本研究尝试将HRM用于水稻F2群体基因分型,同时进行了HRM反应条件优化,为后续将HRM用于BBM14和BBM66中抗性基因定位打下了基础。利用本实验室创制的高抗白叶枯病材料Y73以及高感白叶枯病材料IR24杂交以构建F2群体,选取了22株F2植株。在5μl反应体系及普通PCR程序条件下,本研究对353对STS和SSR分子标记进行了Y73,IR24以及其F1之间多态HRM分子标记筛选,其中103对分子标记表现出多态的HRM曲线。将这103对多态HRM分子标记用于以上F2群体的HRM基因分型,结果显示在5μl反应体系及普通PCR程序条件下,12对STS和SSR分子标记成功地对该F2群体进行了基因型分析。传统的凝胶电泳结果显示,HRM基因分型结果与传统的PCR后电泳检测结果完全一致。为提高STS与SSR分子标记用于HRM基因分型的效率,本研究在另外两种HRM反应条件下,对这103对多态HRM分子标记用于该F2群体基因分型进行了重新的筛选。在5μl反应体系与降落PCR程序中,筛选效率没有明显提高,而在10μl反应体系与降落PCR程序中,除了这12对分子标记外,另外9对分子标记成功地对该F2群体进行了基因分型,筛选效率明显提高。因此,以上结果表明HRM用于水稻F2群体的基因分型具有可行性,且3种HRM体系中,10μl反应体系与降落PCR程序条件时的HRM体系更稳定,更适宜于水稻F2群体基因分型。综合以上研究结果表明,突变体BBM14和BBM66对部分白叶枯病菌抗性稳定,可进行进一步的白叶枯病抗性基因研究。同时,HRM技术在水稻F2群体基因分型中具有可行性,因此,将HRM技术应用于BBM14和BBM66相关抗性基因的研究对于同时加快白叶枯病新抗性基因的定位以及推进HRM基因分型技术在水稻中的应用具有双重作用。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-13
缩略词表  13-14
第1章文献综述  14-28
  1.1 水稻白叶枯病  14-17
    1.1.1 分布与危害  14-15
    1.1.2 致病菌株  15
    1.1.3 抗病基因  15-17
  1.2 水稻突变体库  17-21
    1.2.1 水稻突变体库的构建方法  17-19
    1.2.2 目前主要的水稻突变体库资源  19-21
  1.3 突变体中基因多态性及检测技术  21-22
    1.3.1 突变体中基因多态性  21-22
    1.3.2 基因多态检测技术  22
  1.4 高分辨率溶解曲线技术(HRM)  22-26
    1.4.1 高分辨率溶解曲线原理  23
    1.4.2 高分辨率溶解曲线分析过程  23-24
    1.4.3 高分辨率溶解曲线技术特点  24
    1.4.4 高分辨率溶解曲线应用领域  24-26
  1.5 本研究的目的及意义  26-28
第2章水稻T-DNA突变体库的筛选  28-35
  2.1 前言  28
  2.2 材料与方法  28-30
    2.2.1 材料  28-29
      2.2.1.1 水稻突变体库材料  28
      2.2.1.2 白叶枯病菌株  28
      2.2.1.3 所用试剂  28
      2.2.1.4 仪器设备  28-29
    2.2.2 方法  29-30
      2.2.2.1 水稻发芽  29
      2.2.2.2 水稻水培培养液配制  29
      2.2.2.3 白叶枯病菌株培养基配制  29-30
      2.2.2.4 白叶枯病菌株复壮及培养  30
      2.2.2.5 接种及表型观察  30
  2.3 实验结果  30-33
    2.3.1 白叶枯病抗性突变体  30-31
    2.3.2 类病变突变体  31
    2.3.3 其他突变体  31-33
  2.4 分析与讨论  33-35
    2.4.1 白叶枯病抗性突变体筛选菌株的选择  33
    2.4.2 白叶枯病抗性突变体筛选  33-34
    2.4.3 突变体库中其他突变表型  34-35
第3章水稻白叶枯病抗性突变体BBM14和BBM66生理生化分析  35-49
  3.1 前言  35
  3.2 材料与方法  35-39
    3.2.1 材料  35
      3.2.1.1 突变体材料  35
      3.2.1.2 试剂  35
      3.2.1.3 仪器设备  35
    3.2.2 方法  35-39
      3.2.2.1 水稻材料的发芽  35-36
      3.2.2.2 抗谱分析所用菌株及近等基因系  36
      3.2.2.3 DNA的提取  36
      3.2.2.4 白叶枯病菌株生长曲线分析  36-37
      3.2.2.5 水稻总RNA的提取  37
      3.2.2.6 第一链cDNA的合成  37-38
      3.2.2.7 定量PCR分析  38
      3.2.2.8 T-DNA检测用的引物设计  38
      3.2.2.9 病斑数据统计软件  38-39
  3.3 实验结果  39-47
    3.3.1 BBM14株系M_0代对P10菌株的抗性  39
    3.3.2 BBM14株系M_1群体抗病性及T-DNA检测  39-41
    3.3.3 BBM66株系M_0代对P10菌株抗性  41
    3.3.4 BBM66株系M_1群体抗病性及T-DNA检测  41-42
    3.3.5 BBM14和BBM66接种P10后叶片内菌株生长曲线  42-43
    3.3.6 BBM14和BBM66抗谱及与已知抗性基因的比较  43-46
      3.3.6.1 BBM14和BBM66抗谱分析  43-44
      3.3.6.2 BBM14与BBM66抗谱与已知抗性基因抗谱比较  44-46
    3.3.7 BBM14和BBM66中部分防卫基因表达分析  46-47
  3.4 分析与讨论  47-49
    3.4.1 BBM14与BBM66白叶枯病抗性确认及与T-DNA协同性分析  47
    3.4.2 BBM14与BBM66的抗谱  47-48
    3.4.3 BBM14和BBM66的抗病机理研究  48-49
第4章高分辨率溶解曲线在水稻基因分型中的应用  49-61
  4.1 前言  49
  4.2 材料与方法  49-53
    4.2.1 材料  49-50
      4.2.1.1 水稻材料  49
      4.2.1.2 所用试剂  49
      4.2.1.3 仪器及设备  49-50
    4.2.2 方法  50-53
      4.2.2.1 用于HRM分析的水稻DNA提取  50
      4.2.2.2 HRM分析用引物的合成  50
      4.2.2.3 DNA扩增和HRM分析  50-51
      4.2.2.4 常规PCR体系  51
      4.2.2.5 电泳  51-53
      4.2.2.6 HRM反应条件的优化  53
      4.2.2.7 分析软件  53
  4.3 实验结果  53-57
    4.3.1 多态HRM分子标记的筛选  53-54
    4.3.2 利用多态HRM分子标记对F_2群体进行基因分型  54-55
    4.3.3 HRM反应条件的优化  55-57
  4.4 分析与讨论  57-61
    4.4.1 多态HRM分子标记用于F_2群体基因分型  57
    4.4.2 HRM基因分型反应条件优化  57-58
    4.4.3 可用于F_2群体基因分型的HRM分子标记特征  58-59
    4.4.4 HRM基因分型用于BBM14和BBM66中抗性基因定位  59
    4.4.5 HRM基因分型用于BBM14和BBM66中T-DNA插入检测  59-61
第5章总结与展望  61-63
  5.1 总结  61
  5.2 展望  61-63
参考文献  63-77
附录  77-86
致谢  86-87
攻读硕士期间发表的学术论文  87-88

水稻白叶枯病抗性突变体的筛选与高分辨率溶解曲线在水稻中的应用

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