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水稻花器官相关基因MRG的图位克隆

作　者: 周涯
导　师: 张小明
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻 花器官 稻米品质 遗传分析 图位克隆
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


水稻作为重要的粮食作物和理想的模式植物,其花发育调控的遗传和分子机制研究已成为当今分子生物学的研究热点。水稻的花器官雄蕊和雌蕊是保守的,许多实验结果均证实浆片是双子叶植物花瓣的同源器官,然而外稃和内稃与双子叶植物和其他单子叶植物的花萼器官的对应关系仍存在争议。水稻花发育突变体为研究相关基因表达与功能提供了理想材料,内外稃发育与稻米产量、品质关系密切,可见对水稻内外稃突变体进行研究具有理论和现实意义。从水稻（Oryza sativa L）‘浙粳22’的6。CoY射线辐射诱变群体和‘秀水09’的EMS诱变群体中筛选获得4份月亮型颖壳突变体（moon rice glume,简称mrg）。对突变体mrg进行了表型观察、米质分析、基因的图位克隆和功能分析等,结果如下：1月亮型颖壳突变体mrg形态结构特征：营养生长阶段,月亮型颖壳突变体mrg-1、mrg-2、mrg-3和mrg-4植株形态和野生型植株没有明显差别；突变体mrg浆片、雄蕊和雌蕊正常,但内稃和外稃弯曲,4个突变体表型变异程度略有差异。组织学分析表明,这种差异是由内外稃相互勾合不够紧密造成。2月亮型颖壳突变体mrg稻米品质：稻米外观品质方面,月亮型颖壳突变体粒长和粒宽均较野生型小,长宽比增加,千粒重、垩白率和垩白度降低；稻米加工品质方面,月亮型颖壳突变体稻米的糙米率、精米率和整精米率均较野生型低；稻米营养品质方面,月亮型颖壳突变体蛋白含量较野生型高,为9.917mg/g；稻米蒸煮食味品质方面,月亮型颖壳突变体胶稠度较野生型高,为83.06mm,属于软胶稠度；直链淀粉含量和碱消值较野生型减小,分别为13.18%和7.02,属于低糊化温度,月亮型颖壳突变体的蒸煮品质发生变化。3突变性状的遗传分析：突变体mrg-1和mrg-2分别与粳稻‘浙粳22’杂交,F1表型与野生型一致,说明mrg为隐性突变导致。根据F2表型及χ2测验结果表明,正常株与突变株的比例符合1对基因控制的分离比3：1,即该突变性状是受一对隐性基因控制。4 MRG基因的精细定位和候选基因的克隆分析和确定：利用图位克隆方法,将MRG基因定位于2号染色体InDel标记J59与J95之间,两者相距194Kb,该区域位于AP004081、AP005303和AP005691三个BAC所构成的重叠群上。通过测序得知mrg-1、mrg-2、mrg-3和mrg-4的Os02g0811000基因存在不同形式的突变。根据测序结果,在突变位点存在酶切位点差异。酶切检测突变群体,此突变位点与突变性状完全连锁,确定了Os02g0811000就是MRG的候选基因。5 MRG蛋白分析：MRG基因没有内含子,全长cDNA序列（Genbank登录号：NM001055008.1）为1587bp,其中ORF区为747bp,5’-UTR区为503bp,3’-UTR区为337bp。MRG基因的编码蛋白（Genbank登录号：BAF10387.1或NP 001048473.1）为248个氨基酸,第79-210氨基酸构成DUF640结构域,MRG蛋白的分子量为25.89kD,等电点（PI）为9.62。MRG蛋白具有核定位信号（KKKR,氨基酸205-208）,MRG-YFP融合蛋白亚细胞定位结果显示,MRG蛋白定位在细胞核。MRG蛋白含未知功能DUF640结构域,通过对含该结构域的同源蛋白比对分析,发现MRG蛋白与已报道的G1和LSH1属于不同的分支。DUF640结构域具有保守的氨基酸序列,突变体mrg-2和mrg-3的MRG基因发生单碱基突变的位点都位于该结构域保守位点。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
缩略表  13-15
第一章 文献综述  15-28
  引言  15
  1 植物花发育概述  15-21
    1.1 双子叶植物花发育研究进展  15-18
      1.1.1 经典的ABC模型  15-16
      1.1.2 ABCD模型  16-17
      1.1.3 ABCDE模型  17-18
    1.2 水稻花发育研究进展  18-19
      1.2.1 水稻花的结构特点  18
      1.2.2 水稻花发育ABCDE类基因  18-19
    1.3 水稻花器官突变体定位进展  19-21
  2 稻米品质研究进展  21-24
    2.1 稻米品质评价的内容  22-23
      2.1.1 碾米品质  22
      2.1.2 外观品质  22
      2.1.3 蒸煮与食味品质  22-23
      2.1.4 营养品质  23
    2.2 稻米品质的遗传  23-24
    2.3 稻米品质的相关性  24
  3 图位克隆  24-26
    3.1 图位克隆技术的原理和方法  24-25
    3.2 图位克隆中常用DNA分子标记研究进展  25-26
    3.3 图位克隆技术的研究进展  26
  4 本研究的目的意义  26-28
第二章 水稻花器官相关基因MRG的图位克隆  28-57
  1 材料和方法  28-36
    1.1 供试材料  28
      1.1.1 水稻  28
      1.1.2 细菌菌种和克隆载体  28
      1.1.2 试剂盒和限制性内切酶  28
    1.2 水稻mrg突变体表型分析  28-29
      1.2.1 形态解剖学分析  28
      1.2.2 组织切片  28-29
      1.2.3 花粉育性观察  29
      1.2.4 种子发芽势和发芽率的测定  29
    1.3 水稻mrg突变体稻米品质分析  29-30
      1.3.1 外观品质的测定  29
      1.3.2 碾磨品质的测定  29-30
      1.3.3 蒸煮食味品质与营养品质的测定  30
    1.4 水稻mrg突变体的遗传分析和MRG基因图位克隆  30-32
      1.4.1 水稻总DNA的提取  30
      1.4.2 PCR反应体系和程序  30-31
      1.4.3 遗传分析和定位群体的构建  31
      1.4.4 水稻mrg的初定位  31
      1.4.5 水稻mrg的精细定位  31-32
      1.4.6 目标基因物理图谱的构建  32
      1.4.7 候选基因预测及测序  32
    1.5 水稻MRG-YFP融合蛋白的亚细胞定位  32-33
      1.5.1 MRG-YFP表达载体的构建  32
      1.5.2 MRG-YFP洋葱表皮细胞转化  32-33
    1.6 过量表达载体的设计和构建  33
      1.6.1 水稻MRG基因的克隆  33
      1.6.2 pCAMBIA-1301-35SN-MRG的构建和酶切验证  33
    1.7 补载体的设计和构建  33-34
    1.8 MRG基因启动子连GUS载体的设计和构建  34
    1.9 水稻转基因操作程序  34-35
      1.9.1 愈伤组织诱导及继代  35
      1.9.2 愈伤组织共培养和筛选  35
      1.9.3 抗性愈伤组织的选择  35
      1.9.4 抗性愈伤组织的分化和生根  35
      1.9.5 转基因苗的锻炼和移栽  35
    1.10 生物信息学分析  35-36
      1.10.1 蛋白序列分析和核定位信号预测  35-36
      1.10.2 蛋白序列比对和进化分析  36
      1.10.3 序列登录号  36
  2 结果与分析  36-54
    2.1 突变体mrg的表型特征  36-40
      2.1.1 突变体的植株形态  36-38
      2.1.2 突变体mrg-1的花器官分析  38-40
      2.1.3 突变体mrg-1种子发芽势和发芽率测定  40
    2.2 稻米品质  40-42
      2.2.1 月亮型颖壳突变体稻米的外观品质  40
      2.2.2 月亮型颖壳突变体稻米的加工品质  40-41
      2.2.3 月亮型颖壳突变体稻米的营养品质  41-42
      2.2.4 月亮型颖壳突变体稻米的蒸煮食味品质  42
    2.3 MRG基因的图位克隆  42-48
      2.3.1 遗传分析  42
      2.3.2 MRG基因的染色体定位  42-44
      2.3.3 MRG基因的初定位  44
      2.3.4 MRG基因的精细定位  44-46
      2.3.5 候选基因注解与分析  46
      2.3.6 突变位点的确定  46-47
      2.3.7 MRG基因的酶切分析  47-48
      2.3.8 MRG基因的分子结构分析与预测  48
    2.4 MRG-YFP融合蛋白的亚细胞定位  48-50
      2.4.1 MRG-YFP表达载体的构建  48-49
      2.4.2 MRG-YFP洋葱表皮细胞转化  49-50
    2.5 超表达载体的设计和构建  50
    2.6 互补载体的设计和构建  50-51
    2.7 MRG基因启动子连GUS载体的设计和构建  51-52
    2.8 基因MRG进化分析  52-54
      2.8.1 MRG蛋白进化树构建  52-53
      2.8.2 DUF640结构域氨基酸序列比对  53-54
  3 讨论  54-57
    3.1 突变体mrg的内外稃发育畸形  54
    3.2 突变体与其它花发育突变体的比较  54
    3.3 内外稃发育畸形对mrg稻米品质的影响  54-55
    3.4 MRG基因的图位克隆和分析  55-57
全文结论  57-59
  1 粳稻‘浙粳22’类月亮型颖壳突变体的表型特征  57
  2 粳稻‘浙粳22’月亮型颖壳突变体的米质分析  57
  3 粳稻‘浙粳22’月亮型颖壳突变体的基因图位克隆  57-58
  4 MRG蛋白分析  58-59
参考文献  59-67
致谢  67-68
发表论文目录  68-69

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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