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抗猪圆环病毒2型卵黄抗体的研制及效果的研究

作　者: 许银平
导　师: 马立保；何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 猪圆环病毒卵黄抗体 BALB/c小鼠体外中和试验体内中和试验
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 57次
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内容摘要

本研究制备了抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体,研究了抗体体外和小鼠体内抑制病毒增殖的能力。主要研究内容如下：1.抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体的制备选取32只22周龄健康产蛋鸡,随机分为4组,每组8只,每只为一个重复。对照组注射生理盐水,试验组1：用灭活的PCV2与弗氏佐剂乳化后逐次增加剂量免疫蛋鸡；试验组2：用灭活的PCV2与弗氏佐剂乳化后保持相同剂量免疫蛋鸡；试验组3：用PCV2免疫蛋鸡；共免疫五次。用ELISA和胶体金两种方法检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体水平,水稀释-硫酸铵一次盐析-二次盐析-透析-浓缩提取IgY, BCA法检测每一次提取后所获得的蛋白浓度,SDS-PAGE检测各步骤提取后IgY纯度。结果表明：各试验组蛋鸡的血清抗体水平始终高于卵黄抗体水平,试验组1所获得的抗体效价最高,最高效价可达到1：640,并且持续时间较长,持续时间可达8周以上；通过水稀释-硫酸铵一次盐析-二次盐析-透析-浓缩各步骤提取,每10 ml卵黄液最终可获得卵黄抗体51.67 mg；经SDS-PAGE检测,杂带较少,抗体纯度较高o2.抗猪圆环病毒卵黄抗体的体内外中和试验IgY的最大无毒作用浓度的研究：在96孔细胞培养板中,将卵黄抗体倍比稀释成不同浓度,加入长成良好的细胞,用倒置显微镜观察细胞病变情况；IgY体外中和试验：将卵黄抗体倍比稀释成不同浓度,与200 TCID50的PCV2体外中和1 h后加入长成良好的细胞,培养48 h后收集细胞,提取病毒DNA,通过实时荧光定量PCR测定病毒的拷贝数；IgY体内中和试验：选取30只8周龄SPF级BALB/c小鼠,分为3组,阴性对照组：腹腔注射生理盐水,0.5 ml/只；试验组：IgY与PCV2(107TCID50/ml)中和一个小时后腹腔注射,0.5 ml/只；阳性对照组：腹腔注射PCV2(107TCID50/ml),0.5 ml/只,于7 d、14 d采集血液和组织,检测小鼠体内病毒复制情况和血清抗体水平。IgY细胞毒性试验结果表明：IgY不引起细胞产生CPE,但会促进细胞的生长,产生细胞堆积,并且随着IgY浓度的降低,堆积现象逐渐减少,当IgY浓度为0.9 mg/ml时,堆积现象消失；IgY体外中和试验表明：当IgY的浓度为225μg/ml时,阳性对照组和试验组细胞中PCV2的拷贝数存在显著差异,处理组IgY抑制了病毒的复制,并且随着IgY浓度的增加,病毒的拷贝数逐渐降低；IgY体内中和试验结果表明：当IgY浓度为100 mg/ml时,IgY能够明显抑制小鼠组织中PCV2的增殖。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词  11-13
文献综述  13-35
  1 圆环病毒的研究进展  13-25
    1.1 病毒的理化性质  14
    1.2 病毒的分类  14-15
    1.3 PCV2相关疾病  15-17
      1.3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)  15
      1.3.2 猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)  15-16
      1.3.3 PCV2相关繁殖障碍  16
      1.3.4 猪呼吸道疾病综合症(PRDC)  16
      1.3.5 增生性肠炎  16-17
    1.4 PCV2的诊断技术  17-22
      1.4.1 PCV2抗体的检测技术  17-19
      1.4.2 PCV2抗原的检测技术  19-20
      1.4.3 PCV2的基因组检测  20-22
    1.5 PCV2相关疾病的防制  22-24
      1.5.1 防止混合感染  22
      1.5.2 加强饲养管理  22-23
      1.5.3 加强免疫  23-24
    1.6 PCV2感染动物模型的建立  24-25
      1.6.1 PCV2单独感染动物模型的建立  24
      1.6.2 PCV2混合感染动物模型的建立  24-25
      1.6.3 PCV2感染小鼠模型的建立  25
  2 IgY的研究进展  25-34
    2.1 IgY的形成  25-26
    2.2 IgY的特点  26-28
      2.2.1 IgY的结构及功能特性  26-27
      2.2.2 卵黄抗体的稳定性  27-28
    2.3 IgY的制备技术  28-31
      2.3.1 IgY产生的免疫影响因素  28-30
      2.3.2 IgY的制备  30-31
    2.4 IgY在兽医、人类和免疫诊段学方面的应用  31-34
      2.4.1 IgY在兽医方面的应用  31-32
      2.4.2 卵黄抗体用于预防和治疗人类疾病的应用  32-33
      2.4.3 IgY及免疫诊断学  33-34
  3 本研究的目的、意义和主要内容  34-35
第一章抗猪圆环病毒2型特异性卵黄抗体的制备及分离纯化  35-49
  1 前言  35
  2 材料与方法  35-37
    2.1 主要仪器设备  35
    2.2 主要试剂  35-36
    2.3 试剂配制  36-37
      2.3.1 饱和硫酸铵溶液  36
      2.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂配制  36
      2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂配制  36-37
    2.4 试验动物及分组  37
  3 试验方法  37-41
    3.1 免疫原制备  37
    3.2 蛋鸡的免疫  37-38
    3.3 样品的采集  38
    3.4 IgY的分离、提取、纯化  38-39
    3.5 抗体效价的检测  39
    3.6 抗原最佳包被浓度的确定  39
    3.7 ELISA检测方法  39-40
    3.8 各提取步骤卵黄抗体蛋白含量测定  40
    3.9 SDS-PAGE检测IgY纯度  40-41
  4 结果与分析  41-46
    4.1 血清抗体方阵滴定结果  41-42
    4.2 卵黄抗体方阵滴定结果  42
    4.3 不同免疫方式对鸡血清抗体水平变化的影响  42-43
    4.4 不同免疫方法对鸡卵黄抗体变化的影响  43-44
    4.5 胶体金法检测血清抗体效价  44
    4.6 胶体金法检测卵黄抗体效价  44-45
    4.7 卵黄抗体纯度  45-46
  5 讨论  46-48
    5.1 不同免疫方法对抗体水平的影响  46-47
    5.2 卵黄抗体的分离、提取、纯化  47-48
  6 小结  48-49
第二章猪圆环病毒2型卵黄抗体的体外中和试验  49-64
  1 引言  49
  2 材料和方法  49-64
    2.1 试验材料  49
    2.2 试验仪器  49-50
    2.3 试验试剂  50
    2.4 试验试剂的配制  50-51
    2.5 试验动物  51
    2.6 试验方法  51-56
      2.6.1 卵黄抗体对细胞毒性的测定  51
      2.6.2 病毒感染滴度的测定  51
      2.6.3 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体细胞体外中和试验  51-53
      2.6.4 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体内中和试验  53-56
    2.7 结果与分析  56-61
      2.7.1 卵黄抗体对细胞的毒性试验  56-57
      2.7.2 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体体外中和试验  57-58
      2.7.3 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体小鼠体内中和试验  58-61
    2.8 讨论  61-63
    2.9 小结  63-64
参考文献  64-79
致谢  79

抗猪圆环病毒2型卵黄抗体的研制及效果的研究

内容摘要

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