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广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的真核表达和镇痛活性检测

作　者: 鄢航
导　师: 蒋和生
学　校: 广西大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 广西眼镜蛇蛇毒蛋白凝脂酶A2 昆虫表达系统镇痛
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin, NT)是一种潜在的麻醉剂和解毒药物,在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离难度大,限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此,本研究旨在利用昆虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋白(Cobortoxin, CT)和凝脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)。分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT和PLA2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和PLA2插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM Dual启动子PH和p10的下游,获得不携带His标签的重组质粒：pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和携带His标签的重组质粒：pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。将6种穿梭载体转入DH10Bac中,用抗生素(庆大霉素、卡那霉素和四环素)和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定,得到携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体：BM-CT、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT, BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。利用转染试剂CellfectinⅡ将携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体和空载体转入Sf9昆虫细胞,经PCR鉴定,成功获得了7种病毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞,经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达,结果显示,在细胞裂解上清中检测到特异目的条带,提示目的蛋白是可溶的。分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目的蛋白HCT和HPLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性,结果显示：CT镇痛效果极显著(P<0.05),并且Ni柱纯化的效果显著好于电洗脱(P<0.05)。HPLA2的镇痛效果不很明显(P>0.05)。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-20
  1 眼镜蛇神经毒素  10-13
    1.1 眼镜蛇神经毒素的种类  10
    1.2 眼镜蛇神经毒素的结构  10-11
    1.3 眼镜蛇神经毒素的作用  11-12
    1.4 眼镜蛇神经毒素分离纯化概述  12-13
  2 眼镜蛇蛇毒蛋白  13
    2.1 眼镜蛇毒蛋白的发现  13
    2.2 眼镜蛇毒蛋白的结构  13
    2.3 眼镜蛇毒蛋白的功能  13
  3 凝脂酶A_2  13-15
    3.1 蛇毒凝脂酶A_2的作用原理和结构  14
    3.2 蛇毒凝脂酶A_2的作用  14-15
  4 广西眼镜蛇概述  15
  5 昆虫杆状病毒表达载体研究进展  15-19
    5.1 昆虫杆状病毒转移载体和原理  16-19
    5.2 昆虫杆状病毒表达系统的优越性  19
  6 研究目的和意义  19-20
第二章广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的克隆和序列分析  20-42
  1 材料与方法  20-33
    1.1 试验材料  20-22
    1.2 实验方法  22-33
  2 结果与分析  33-39
    2.1 广西眼镜蛇血液的DNA提取  33
    2.2 广西眼镜蛇毒腺RNA提取  33
    2.3 广西眼镜蛇毒腺cDNA的内参基因(GAPDH)PCR检测  33
    2.4 CT目的基因成熟肽序列的获得  33-34
    2.5 PLA_2目的基因成熟肽序列的获得  34-35
    2.6 两种基因四种pMD质粒的鉴定  35-36
    2.7 测序结果  36-38
    2.8 同源性分析  38-39
  3 讨论与小结  39-42
    3.1 神经毒素基因来源的选择  39
    3.2 成熟肽序列克隆方法的比较  39-40
    3.3 神经毒素的保守性  40
    3.5 小结  40-42
第三章 CT和PLA_2昆虫表达载体的构建和体外表达  42-68
  1 材料与方法  42-57
    1.1 材料  42-46
    1.2 实验方法  46-57
  2 结果与分析  57-64
    2.1 单基因真核穿梭载体构建  57
    2.2 双基因共表达真核穿梭载体构建  57-58
    2.3 重组Bacmid的筛选与鉴定  58-59
    2.4 重组BacMid质粒提取  59
    2.5 质粒浓度测定  59-60
    2.6 Sf9细胞的培养  60
    2.7 细胞病变情况观察  60-61
    2.8 重组杆状病毒的DNA鉴定  61-62
    2.9 目的蛋白表达的位置检测  62-64
  3 讨论与小结  64-68
    3.1 转座过程中筛选效率  64
    3.2 昆虫Sf9细胞培养  64
    3.3 Sf9细胞的转染效率分析  64-65
    3.4 眼镜蛇CT蛋白的分子大小分析  65
    3.5 目的蛋白的表达量分析  65
    3.6 小结  65-68
第四章 CT和PLA_2蛋白的纯化和镇痛活性的检测  68-78
  1 材料与方法  68-73
    1.1 材料  68-70
    1.2 实验方法  70-73
  2 结果和分析  73-76
    2.1 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳  73-74
    2.2 蛋白定量  74-75
    2.3 各组的扭体次数  75-76
  3 讨论和小结  76-78
    3.1 讨论  76
    3.2 小结  76-78
第五章结论  78-80
参考文献  80-84
致谢  84-86
攻读硕士学位期间发表的学术论文  86

广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的真核表达和镇痛活性检测

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