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Wnt信号诱导人晶状体上皮细胞上皮间充质转化和增殖的研究

作　者: 包秀丽
导　师: 汤欣
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: Wnt3a 晶状体上皮细胞 上皮间充质转化 Wnt/β-catenin信号通路
分类号: R776.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：后囊下混浊(posterior capsular opacification, PCO)是白内障摘除术后最常见的并发症,常常导致术后视力下降。晶状体上皮细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和增殖在PCO的发生和发展中起重要作用。Wnt配体蛋白参与调控细胞增殖、迁移及分化等众多生理过程,对人晶状体上皮细胞中Wnt3a介导的经典wnt信号通路目前研究甚少。本研究将wnt3a与经典wnt信号通路相关联,通过构建wnt3a过表达载体应用转染技术使人晶状体上皮细胞中过表达wnt3a配体蛋白,激活经典wnt信号通路,探讨其对晶状体上皮细胞EMT和增殖能力的影响,初步明确wnt在晶状体上皮细胞发生PCO的作用机制。同时,力求从中找到新的靶点。方法：1.构建Wnt3a过表达载体,转化大肠杆菌,酶切、测序进行鉴定。2.应用Lipo2000转染技术转染Wnt3a过表达载体,人晶状体上皮细胞HLE B-3细胞和SRA01/04细胞过表达Wnt3a蛋白,用Western Blotting技术验证其表达。3.用趋化运动实验和划痕实验检测Wnt3a过表达对晶状体上皮细胞的迁移运动能力影响。4.采用MTT和流式细胞仪检测Wnt3a过表达对细胞增殖能力的影响。5.用Western Blotting检测Wnt3a过表达后其下游信号分子β-catenin的活化程度。用免疫荧光的方法检测β-catenin在细胞中的定位情况,观察在Wnt3a刺激后,它们的分布变化,进一步明确Wnt/β-catenin信号通路的激活状态。6.应用Western Blotting方法检测Wnt3a过表达对晶状体上皮细胞EMT标志蛋白和相关核内靶基因表达的影响,用免疫荧光的方法检测上皮和间充质标记蛋白在细胞中的定位情况,进一步明确Wnt/β-catenin信号通路在调控晶状体上皮细胞形成PCO中的分子机制。结果：1.成功构建Wnt3a-pcDNA3真核表达载体,基因测序与Genebank一致。2.正常人晶状体上皮细胞系仅有少量Wnt3a表达。Wnt3a-pcDNA3瞬时转染后获得Wnt3a过表达晶状体上皮细胞系。3. wnt3a过表达上调HLE B-3细胞内β-catenin的蛋白表达,并促使HLE B-3细胞和SRA01/04细胞内的β-catenin细胞定位由胞浆转入胞核。4.与对照组相比,Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的迁移运动能力比对照组细胞明显增强(P<0.01)。5. Wnt3a过表达促进HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的增殖(P<0.01),细胞周期分析发现在S期细胞的比例升高。6.与对照组相比,Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的上皮表型E-cadherin表达降低,间质表型fibronectin表达升高；并且经免疫荧光实验证实,Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞发生EMT。7. Wnt3a过表达使HLE-B3细胞和SRA01/04细胞中Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调。结论：1. Wnt3a-pcDNA3真核表达载体能有效上调人晶状体上皮细胞Wnt3a蛋白的表达,使Wnt/β-catenin信号通路活化。2. Wnt3a过表达能够增强晶状体上皮细胞的运动迁移能力。3. Cyclin D1和c-Myc是Wnt/p-catenin信号通路的下游信号分子,Wnt3a通过激活Wnt/β-catenin信号通路,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调,促进晶状体上皮细胞增殖。4. Wnt3a过表达诱导晶状体上皮细胞发生上皮间充质转化。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-11
缩略语  11-12
前言  12-16
  研究现状、成果  12-14
  研究目的、方法  14-16
一、Wnt3a-pcDNA3真核表达载体的构建和验证  16-26
  1.1 对象和方法  16-21
    1.1.1 实验材料  16-17
    1.1.2 实验方法  17-21
  1.2 结果  21-22
  1.3 讨论  22-25
  1.4 小结  25-26
二、Wnt/ (3 -eaten i n信号通路的研究  26-60
  2.1 对象和方法  26-35
    2.1.1 细胞系  26
    2.1.2 常规试剂和耗材  26-27
    2.1.3 主要试剂  27-29
    2.1.4 主要仪器设备  29-30
    2.1.5 实验方法  30-35
  2.2 结果  35-50
    2.2.1 利用脂质体转染技术过表达人晶状体上皮细胞中Wnt3a蛋白  35-36
    2.2.2 Wnt3a过表达激活Wnt/β-catenin信号通路  36-38
    2.2.3 Wnt3a过表达促进晶状体上皮细胞EMT  38-43
    2.2.4 Wnt3a过表达增强晶状体上皮细胞运动迁移能力  43-48
    2.2.5 Wnt3a过表达增强晶状体上皮细胞增殖能力  48-50
  2.3 讨论  50-59
  2.4 小结  59-60
全文结论  60-62
论文创新点  62-63
参考文献  63-71
发表论文和参加科研情况说明  71-72
综述  72-105
  综述参考文献  88-105
致谢  105

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 晶状体与玻璃体疾病 > 白内障
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