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化脓性中耳炎大鼠中耳黏膜细菌生物膜的形成特点及药物清除

作　者: 侯炜
导　师: 肖红俊
学　校: 华中科技大学
专　业: 耳鼻咽喉科
关键词: 铜绿假单胞菌化脓性中耳炎细菌生物膜扫描电镜激光共聚焦显微镜克拉霉素环丙沙星
分类号: R764.21
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部分化脓性中耳炎大鼠中耳黏膜细菌生物膜的形成特点及意义目的建立化脓性中耳炎大鼠模型,观察细菌生物膜在模型动物中耳黏膜的形成特点,探讨细菌生物膜在慢性化脓性中耳炎发病机制中的作用及临床意义。方法将28只大鼠分为6个实验组和1个对照组,每组4只；另外取4只大鼠进行HE染色观察。除对照组外所有实验组大鼠及2只将行HE染色的大鼠用浓度为1.0×106CFU/m1的铜绿假单胞菌菌液经鼓膜穿刺途径感染双侧中耳腔。分别在接种细菌后第1、3、6、10、15、21天,将一个实验组的4只大鼠麻醉后,用电耳镜观察双侧鼓膜,从大体病理学水平对炎症的严重程度进行评分(用0、1、2、3、4表示炎症程度,0为币常,4为最严重)；处死后取双侧听泡,左侧听泡制备成扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)标本并观察中耳黏膜细菌生物膜形态,右侧听泡采用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察中耳黏膜细菌生物膜形态。对照组在第0天即处死取材。两只末感染的将行HE染色的大鼠亦在第0天处死取材；两只感染的将行HE染色的大鼠在第7天处死取双侧听泡。用常规方法制作HE切片,并用光学显微镜进行观察。结果(1)HE染色观察：被感染的大鼠中耳黏膜炎性细胞浸润,其间可见新生毛细血管形成,表明经鼓膜注菌7天时已形成化脓性中耳炎。(2)用扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察大鼠中耳黏膜标本,均在接种细菌第6天左右观察到细菌生物膜形成,到第10天形态更加典型,并在3周内形态保持稳定。(3)用电耳镜观察大鼠鼓膜可以看出,中耳炎炎症感染程度在接种细菌10天内逐渐加重,10天时达到高峰并持续至第3周。1日组与6日组、6日组与10日组鼓膜炎症状态评分比较,差异有统计学意义(t=2.55、t=3.99；P<0.05、P<0.01)。结论(1)本实验动物模型细菌生物膜形成过程为：1-5天是细菌粘附、聚集阶段,6天时细菌生物膜三维结构初步形成,10天左右达到成熟稳定状态。(2)随着中耳黏膜细菌生物膜的生长与成熟,中耳炎炎症也在逐渐加重,提示中耳炎炎症感染的严重程度与中耳黏膜细菌生物膜的成熟状态密切相关。第二部分克拉霉素与环丙沙星联合应用对大鼠中耳黏膜铜绿假单胞菌生物膜的清除作用目的在已形成铜绿假单胞菌生物膜的大鼠中耳腔内局部使用环丙沙星及克拉霉素,观察单独应用氟喹诺酮类药物环丙沙星以及与大环内酯类药物克拉霉素联合应用对动物体内铜绿假单胞菌生物膜的清除效果。方法将36只大鼠随机分为3组：对照组(A组)、环丙沙星组(B组)、环丙沙星克拉霉素联合组(C组),每组12只。所有大鼠右耳经鼓膜穿刺向鼓室注入铜绿假单胞菌菌液,建立化脓性中耳炎模型。10天后,各组分别经右侧鼓膜穿刺向鼓室内注入生理盐水、环丙沙星药液、环丙沙星克拉霉素混合药液,每天1次。在第1次给药后的第1、3、8、14天,每组各处死3只大鼠,取右侧听泡,对中耳黏膜行扫描电镜检查。所得图像经ImageJ软件分析得出黏膜表面细菌生物膜覆盖率。结果(1)A、B两组第3、8、14天细菌生物膜覆盖率保持在90%左右,在3个时间点上的差异无统计学意义,且同一时间点上A、B两组之间比较,差异亦无统计学意义。(2)C组在3个时间点上的细菌生物膜覆盖率分别为88.11±6.09%、33.94±13.53%、19.52±9.34%,逐渐递减,三者两两比较,差异有统计学意义(tc3&c8.tc3&c14、tc8&c14分别为14.14、23.83、3.40,P值均<0.01,)。(3)C组在第3天与A组、B组比较,其细菌生物膜覆盖率与后两者的差异无统计学意义；C组在第8、14天与A组、B组比较,其细菌生物膜覆盖率小于后两者,与后两者的差异有统计学意义(tc8&A8.tc8&B8、tc14&A14、tc14&B14分别为15.36、15.03、27.26、27.97,P值均<0.001)。结论铜绿假单胞菌造成大鼠中耳黏膜形成细菌生物膜后,鼓室内联合应用环丙沙星和克拉霉素8天以上对细菌生物膜有明显清除作用,而单独应用环丙沙星对中耳黏膜的细菌生物膜无明显清除作用。

全文目录

主要缩略词及中英文对照  6-7
前言  7-10
参考文献  10-11
中文摘要  11-14
ABSTRACT  14-18
第一部分化脓性中耳炎大鼠中耳黏膜细菌生物膜的形成特点及意义  18-34
  材料与方法  20-24
  结果  24-26
  讨论  26-29
  附图  29-32
  参考文献  32-34
第二部分克拉霉素与环丙沙星联合应用对大鼠中耳黏膜铜绿假单胞菌生物膜的清除作用  34-49
  材料与方法  35-38
  结果  38-40
  讨论  40-44
  附图  44-47
  参考文献  47-49
综述  49-74
  摘要  49
  引言  49
  一.细菌生物膜基本概念  49-50
  二.细菌生物膜的生长过程  50-52
  三.细菌生物膜的QS系统  52-53
  四.细菌生物膜耐药  53-56
  五.耳鼻喉科中的细菌生物膜疾病  56-65
  结论  65-66
  参考文献  66-74
附录  74-75
致谢  75

化脓性中耳炎大鼠中耳黏膜细菌生物膜的形成特点及药物清除

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