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与HERV-K相关的一种未知功能的mRNA在头颈部肿瘤组织中表达增加

作　者: Jyotsna Shakya
导　师: 刘剑凯
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学
关键词: 人类内源性逆转录病毒序列(HERV) 长末端重复序列(LTR) HERVK-Rec蛋白反转录转座子序列分析
分类号: R739.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景人类内源性逆转录病毒序列（HERV）源于数百万年前逆转录病毒通过感染生殖细胞整合到人类基因组而被遗传下来，存在于人类基因组中。HERV在人类细胞中通过反转录，插入突变以及癌基因激活等各种方式发挥各种功能作用。在人类基因调控中发挥重要作用的启动子和增强子大多都存在于HERV（LTR的区域）的长末端区域。所有HERV亚家族中，HERVK被发现是最有致病潜力的，HERVK具有活跃的ENV和Gag蛋白的开放阅读框（ORF）。Rec和Np9是两个重要的癌基因蛋白，他们是HERV-Kenv基因mRNA的拼接产物，在黑色素瘤，乳腺癌和其他癌症组织，特别是在生殖细胞肿瘤如畸胎瘤中被检测到。材料和方法培养Hep2(Human laryngeal carcinoma),Hek293(Human Embryonic Kidney), NB4(Human Acute Promyelocytic leukemia) and K562(Human Chronic MyelogenousLeukemia)几种不同的细胞系，采集临床手术中切除的头颈部肿瘤和非肿瘤患者的组织样本。首先应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR法）进行了半定量分析，然后应用SYBR Green实时定量PCR的方法检测分析。共71个组织样本用于RNA提取之后，用DNAase消化可能污染的基因组DNA，采用QuantiTect Reverse transcription Kitfrom Qiagen进行逆转录反应合成cDNA中还包含一步去除基因组DNA,以保障RT-PCR方法进行检测得到的扩增产物来源于mRNA。用Rec引物扩增得到的大约300bp的PCR产物进行了TA克隆和测序。用NCBI的BLAST比对程序和开放阅读框搜索软件进行序列分析，并通过信号4.0服务器以鉴定在开放阅读框的氨基酸序列中是否存在信号肽序列。结果与分析本研究中，我们首先选择喉癌细胞株Hep2和人胚胎肾细胞株Hek293细胞及部分头颈部肿瘤和非肿瘤组织，应用Büscher等研究黑色素瘤时曾经用过的引物检测HERV K rec的基因表达。此对上游引物和下游引物分别位于剪接供体之前和剪接受体之后。研究发现HERV K env两次剪接的产物（大约600bp含rec序列）和单一次剪接产物（大约300bp）在Hep2中均能检测到；而在Hek293细胞中只检测得到两次剪接的产物，检测不到单一次剪接产物；在部分头颈部肿瘤和非肿瘤组织中HERVK env两次剪接的产物非常少或检测不到，而单一次剪接的产物(不含rec基因序列)在大约50%的头颈肿瘤组织中被检测到。目前，HERV K env单一次剪接产物全长大约为1.5kb mRNA的功能尚不清楚。本实验中单一次剪接产物（大约300bp）通过TA克隆进行了测序得到338bp长度的序列。应用NCBI的BLAST比对分析揭示此单一次剪接产物338bp mRNA，与HERV-K的LTR序列部分高度同源，分别与畸胎瘤和胚胎干细胞来源的未知功能基因序列部分高度同源；338bp mRNA序列中一个短的含54个氨基酸的开放阅读框被发现，其中还发现了信号肽的存在。由于考虑到我们所用的下游引物与Genbank报道的HERV-K相应序列存在多个碱基序列的不同，可能影响了实际上该序列在头颈部肿瘤组织的表达，我们在338bp的基础上又设计了新的引物，称为P2引物。利用P2引物对头颈部肿瘤组织和非肿瘤组织cDNA做实时定量PCR分析，扩增产物为315bp。结果显示肿瘤组织的阳性表达率(~80%)，而在非肿瘤组织的阳性表达率较低(~17%)，二者差异显著；肿瘤组织的阳性表达量高于非肿瘤组织的阳性表达量，但无统计学意义；而利用P2引物在4种细胞系中均得到阳性扩增。结论与HERV-K相关的一种未知功能的mRNA在头颈部肿瘤组织的阳性表达率明显高于非肿瘤组织，此结果表明与HERV-K相关的这种mRNA可能在头颈部肿瘤的发生发展中具有重要的作用；此HERV-K相关的mRNA分别与畸胎瘤和胚胎干细胞来源的未知功能基因部分序列高度同源，这说明此序列在细胞增殖和或细胞分化中也具有重要功能。而且,开放阅读框的存在及其中含有信号肽序列的发现提示此HERV-K相关的mRNA可以翻译成特异的蛋白质，调节细胞繁殖或分化，或者其相应的DNA序列可以作为反转录转座子作用于其它特异基因调节细胞的增殖或参与肿瘤的发生发展。但目前缺乏适当的证据和深入的研究，此与HERV-K相关的未知mRNA的功能尚不清楚。因此，应该进行进一步详尽的实验研究以期发现它的特殊功能和在人类基因组中存在的意义。

全文目录

Abstract  4-7
摘要  7-14
Chapter 1-Introduction  14-18
  1.1 Human endogenous retrovirus  14-15
  1.2 Classification of HERVs  15-18
Chapter 2-Literature Review  18-22
  2.1 Evolutionary aspects of HERV  18-19
  2.2 HERV and Cancer  19-20
  2.3 Possible mechanisms for pathogenesis and cancer  20-22
Chapter 3-Materials and methods  22-38
  3.1 Cells and clinical samples  22-31
    3.1.1 Cell culture  22-24
    3.1.2 RNA isolation from cell lines  24-25
    3.1.3 RNA Isolation  25-26
    3.1.4 Tissue RNA isolation  26-31
    3.1.5 Measurement of RNA concentration  31
  3.2 Reverse transcriptase-polymerase chain reaction  31-32
    3.2.1 Semi-quantitative (Conventional) PCR  31-32
    3.2.2 Real time PCR (Quantitative PCR)  32
  3.3 TA Cloning and sequencing  32-37
    3.3.1 Principle  33-34
    3.3.2 Isolation of DNA from agarose gel  34
    3.3.3 Ligation reaction  34-35
    3.3.4 Transformation of Ligated Vector  35-36
    3.3.5 Growth of Bacterial Cultures in tubes or flasks  36
    3.3.6 Plasmid Purification by Tiangen Kit  36-37
  3.4 Statistical analysis  37-38
Chapter 4-Result  38-46
  4.1 Sequence BLAST Analysis  40-42
  4.2 ORF Finding Analysis  42-44
  4.3 Quantitative PCR Results and Statistical Analysis  44-45
  4.4 Graphical Representations  45-46
Chapter 5-Discussion  46-49
Chapter 6-Conclusion  49-50
Chapter 7-References  50-56
Chapter 8-Resume  56-57
Chapter 9-Acknowledgements  57

与HERV-K相关的一种未知功能的mRNA在头颈部肿瘤组织中表达增加

内容摘要

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