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5-氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备及其光动力疗法抑制人皮肤鳞癌A-431细胞体外增殖研究

作　者: 石磊
导　师: 王宏伟; 王秀丽
学　校: 安徽医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 鳞状细胞癌光动力治疗 5氨基酮戊酸纳米粒聚乳酸羟基乙酸
分类号: R739.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景皮肤癌是人类最常见的肿瘤之一，皮肤鳞状细胞癌（SCC）约占全部皮肤癌的20%。常规采用手术、激光、冷冻、放疗等直接去除或破坏肿瘤组织，存在组织结构破坏性大、易复发、复发后再次治疗困难等诸多限制。5-氨基酮戊酸光动力治疗（ALAPDT）是一种全新的治疗技术，通过光源、氧气和5-氨基酮戊酸(ALA)的相互作用来破坏肿瘤细胞和肿瘤组织。ALA在肿瘤细胞内转换成内源性光敏性物质原卟啉IX(PpIX)，在特定波长的照射下，PpIX使氧气转换成有活性的单态氧，单态氧氧化损伤细胞器和生物分子，导致肿瘤死亡。ALAPDT的优势在于创伤性小，治疗后不影响美观、不破坏特殊部位的结构和功能，病人耐受性好，可在同一部位重复多次治疗。但是ALAPDT的缺点是治疗深度有限，在治疗深在性侵袭性皮肤SCC时疗效还不甚理想。这主要是因为给药后ALA在深部SCC组织中的浓度低、分布不均，光动力反应的效率有限。基于ALAPDT治疗机制和存在不足，我们设想开展以下两方面研究，以提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效：1．提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率；2．提高ALA在组织中的渗透深度、分布的均匀性，对肿瘤的靶向选择性。因此，本研究设想通过纳米粒药物运输系统（NDDS）来提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力，增强光动力反应效率从而提高疗效。NDDS指的是利用纳米粒包裹运输药物。从纳米粒的安全性出发，本研究选择聚乳酸羟基乙酸纳米粒（PLGANPs）包裹运输光敏剂ALA。希望制备出5氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒（ALAPLGANPs），通过增强光敏剂ALA的稳定性、提高SCC细胞吸收ALA的效率、提高原卟啉IX的生成量，从而提高ALA的光动力反应效率。此外，纳米粒还有EPR效应（enhancedpermeability and retention effect，EPR effect），能提高ALA对皮肤SCC组织的靶向选择性。所以，我们设想通过ALAPLGANPs的应用来提高ALAPDT治疗皮肤SCC的疗效。目的通过PLGANPs装载ALA，增强PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。包括⑴建立ALA的微量测定方法。⑵制备ALAPLGANPs并对其进行表征。⑶评价ALAPLGANPs PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。方法⑴ALA的检测：采用荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法对ALA进行检测，以荧光胺作为荧光衍生化试剂，使用C18柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（30︰70）为流动相，激发波长和发射波长为398nm和480nm。⑵ALAPLGANPs的制备和表征：采用超声-复乳法制备ALA PLGANPs。超声功率：120w；超声时间：初乳40s，复乳40s；ALA浓度（w/v）：2.02%，内水相（PBS（pH5））体积：0.52ml；PLGA浓度（w/v）：7.5%，并以30%甘露醇为支架剂进行冷冻干燥。采用激光粒度分析仪测定纳米粒粒径，荧光胺衍生化HPLC-荧光法检测ALAPLGANPs的包封率、载药量、缓释。扫描电镜观察ALAPLGANPs形态，红外光谱仪测定结构，差示扫描量热仪测定物相。⑶ALAPLGANPs PDT抑制鳞癌A431细胞体外增殖：鳞癌A431细胞与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs (相当于0.1mMALA)无血清培养基、以及含有0.1mM ALA无血清培养基分别避光孵育4h后采用透射电镜进行细胞形态学研究。接着，鳞癌A431细胞分别与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs、2.7mg/mlPLGA NPs以及0mM（空白对照），0.1mM，1mM，5mM，10mM ALA的无血清培养基避光条件下共孵育，于孵育1h，2h，3h，4h，5h，6h，8h，12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h后，测定生成的原卟啉IX荧光强度。最后，采用MTT法检测ALA PLGANPs PDT对A431细胞体外增殖的抑制作用。实验分为2.7mg/mlALA PLGA NPs PDT组，0.1mM ALA PDT组,1mM ALA PDT组，2.7mg/ml ALAPLGA NPs避光组，0.1mM ALA避光组，1mM ALA避光组，单纯红光组，以及阴性对照组。孵药24h后，采用635nm He-Ne激光器（波长635nm,8J/cm2，8.6mW/cm~2）照射，再24h后MTT法观察结果。结果⑴以荧光胺衍生化HPLC-荧光法测定ALA，ALA在0.0475～47.5g/ml浓度范围内线性关系良好。回收率为99.2％，RSD为1.46%。⑵采用超声-复乳法制得的ALAPLGANPs冻干粉平均粒径为65.6±26nm,包封率为65.8±7.2%，载药量为0.62±0.27%，6h左右释药量为80%，纳米粒大小均匀，表面光滑。ALA在PLGANPs中结构无变化，但形成了新的物相。⑶ALA PLGA NPs与鳞癌A431细胞共孵育后，大量ALAPLGANPs被鳞癌细胞吸收，且主要集中于细胞质中。ALAPLGANPs或ALA与鳞癌A431细胞敷育1-24h，产生的原卟啉IX荧光强度随时间递增。孵育6h时，2.7mg/mlALAPLGANPs（相当于0.1mMALA）生成的原卟啉IX荧光强度高于各浓度的游离ALA，与0.1mMALA相比有统计学差异（P<0.01），但与1mMALA相比无统计学差异（P>0.01）。孵育24h时，2.7mg/mlALAPLGANPs产生的原卟啉IX荧光强度大于0.1mM ALA（P <0.01），小于1mM ALA (P <0.01)。体外增殖实验结果显示0.1mM ALA、1mM ALA与2.7mg/ml ALA PLGA NPs对鳞癌A431细胞无明显的暗毒性，单纯红光对A431细胞也无明显的杀伤作用。孵育6h时2.7mg/mlALAPLGANPs PDT对A431细胞的杀伤作用明显高于0.1mM ALA（P<0.01），与1mM ALA PDT相当（P>0.01）。孵育24h，2.7mg/ml ALAPLGA NPs PDT对A431细胞的杀伤作用也明显强于0.1mM ALA PDT（P=0.006，P<0.01），但小于1mM ALA PDT。结论⑴荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法操作简单，能准确地对微量ALA进行测定；⑵采用优化后的超声-复乳法制备出的ALAPLGANPs粒径、形态理想，包封率、载药量可，再分散性好；⑶PLGANPs装载ALA能有效地增强ALAPDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。

全文目录

中文摘要  6-9
Abstract  9-14
英文缩略词表  14-15
前言  15-24
  参考文献  19-24
第一部分  24-32
  1 引言  24
  2 实验材料  24-25
  3 方法与结果  25-29
  4 讨论  29-30
  5 结论  30-31
  6 参考文献  31-32
第二部分  32-58
  1 引言  32-33
  2 材料与方法  33-38
  3 结果  38-51
  4 讨论  51-53
  5 结论  53
  6 参考文献  53-58
第三部分 ALA PLGA NPs 光动力疗法抑制人皮肤鳞癌 A-431 细胞体外增殖研究  58-79
  1 引言  58-60
  2 材料与方法  60-64
  3 结果  64-69
  4 讨论  69-73
  5 结论  73-74
  6 参考文献  74-79
附录  79-80
在学期间的研究成果目录  80-81
致谢  81-83
课题综述 1  83-92
  参考文献  88-92
课题综述 2  92-100
  参考文献  97-100

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