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微粒体前列腺素E合酶1调控EP2受体促进肝癌细胞恶性生物学行为的实验研究

作　者: 倪慕兰
导　师: 黄爱民
学　校: 福建医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: mPGES1 肝细胞癌 过表达慢病毒载体 EP2
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：构建并鉴定微粒体前列腺E合酶1（mPGES1）过表达慢病毒载体；观察mPGES1基因过表达后对肝癌细胞Huh-7体外增殖、迁移侵袭以及体内成瘤能力的影响；检测过表达或下调mPGES1对肝癌细胞中前列腺素E2（PGE2）及其受体EP1、EP2、EP3和EP4表达水平的影响。探讨mPGES1调控PGE2及其受体的信号途径促进肝癌细胞增殖、迁移侵袭的可能机制。方法：（1）通过PCR特异性扩增目的基因mPGES1全长。纯化、酶切后与GV287载体连接得到目的基因重组质粒，与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，包装生产mPGES1过表达慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP）。低温超速浓缩病毒液并检测病毒滴度。（2）使用构建的pGC-LV-mPGES1-GFP感染Huh-7细胞（过表达组），并设pGC-LV-NC-GFP（空载体组）组和未感染组。采用PCR、Western blot等方法鉴定mPGES1基因过表达后的mRNA、蛋白表达水平。采用MTT方法、基质黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验及流式细胞技术检测mPGES1基因过表达前后Huh-7细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭以及细胞周期的变化；将三组细胞分别接种于裸鼠皮下，观察各组裸鼠移植瘤生长情况；第21d取瘤，肉眼和镜下观察移植瘤形态差别。（3）用酶联免疫吸附实验（Elisa法）检测过表达或下调mPGES1后肝癌细胞Huh-7或HepG2中PGE2表达水平变化，real-time PCR和Western blot检测过表达或下调mPGES1后肝癌细胞Huh-7或HepG2中PGE2受体EP1、EP2、EP3和EP4表达水平变化。结果：（1）成功构建过表达mPGES1的慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP），测定病毒生物学滴度为2×108TU/mL。（2）与空载体组、未感染组相比，过表达组的mPGES1mRNA和蛋白表达明显升高。（3）与空载体组、未感染组相比，过表达mPGES1的Huh-7细胞体外增殖、黏附、侵袭和迁移能力均不同程度升高。（4）流式细胞术检测结果显示过表达mPGES1的Huh-7细胞处于S期的比例高于空载体组和未感染组。（5）裸鼠移植瘤模型建立过程中，过表达组移植瘤生长速度较其他两组快；接种后21d收获移植瘤，过表达组移植瘤体积及重量均大于其他两组。（6）与空载体组、未感染组相比，过表达mPGES1后Huh-7细胞中PGE2表达水平明显升高；PGE2的EP2表达水平明显升高，EP1、EP3和EP4表达三组中无明显差异。（7）与LV-mPGES1-NC组、control组相比，LV-mPGES1-shRNA下调mPGES1后HepG2细胞中PGE2表达水平明显下降；PGE2的EP2表达水平明显下降，EP1、EP3和EP4表达三组中无明显差异。结论:1.成功构建过表达mPGES1的慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP），高效转染Huh-7细胞，可稳定、显著的提高mPGES1基因的表达。2. mPGES1基因过表达促进肝癌细胞体外的增殖、黏附及迁移侵袭能力，并且促进Huh-7细胞裸鼠体内成瘤。3. mPGES1可能通过调控PGE2-EP2途径促进肝癌细胞的恶性生物学行为。

全文目录


英、汉缩略名词对照表  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
第一部分 mPGES1 过表达慢病毒载体的构建  10-28
  前言  10-12
  材料与方法  12-22
  结果  22-26
  讨论  26-28
第二部分 过表达 mPGES1 基因促进肝癌细胞 Huh-7增殖、侵袭及转移的体内外实验  28-49
  前言  28-30
  材料与方法  30-37
  结果  37-47
  讨论  47-49
第三部分 mPGES1 调控 PGE2及其受体 EP2 的表达  49-66
  前言  49-51
  材料与方法  51-54
  结果  54-64
  讨论  64-66
结论  66-67
参考文献  67-73
致谢  73-74
综述  74-83
  参考文献  79-83

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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