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NDV7793体外激活人NK细胞对人肝癌HepG2细胞株杀伤机制的初步研究

作　者: 王立芳
导　师: 樊晓晖
学　校: 广西医科大学
专　业: 免疫学
关键词: NDV7793 NK细胞 HepG2 TRAIL IFN-γ
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景在我国肝癌是一种高发癌症,在恶性肿瘤死亡中居第三位,号称“癌中之王。每年死于肝癌的病人约11万,占世界肝癌死亡人数的45%。由于受到食入黄曲霉毒素B含量较高的食物及乙型肝炎病毒表面抗原携带率较高等致癌因素的影响,广西原发性肝癌的发病率居高不下。目前,国内外临床针对肝癌的治疗还多数依赖于手术、放疗、化疗等治疗手段,但放疗、化疗等传统疗法存在毒副作用大、易复发、花费高等难以克服的弊端,故临床上迫切需要寻找更多有效的疗法。近年来,细胞免疫治疗等生物免疫疗法治疗肝癌被寄予厚望,希望化疗联合生物免疫治疗能彻底控制肝癌的复发,从而达到治愈肝癌的目的。生物免疫治疗是一种新兴的且具有广泛应用前景的肿瘤治疗新模式。研究表明,在肿瘤的生物治疗模式中,免疫细胞发挥着重大的作用。NK细胞是存在于骨髓和外周血的一类淋巴细胞,自1975年发现NK细胞以来就一直被认为是主要的杀癌细胞。NK细胞约占外周血淋巴细胞数量的10%-15%,是非特异性免疫的重要组成部分,不需致敏即能杀伤肿瘤和病毒感染细胞,但对宿主正常的自身组织和细胞并无毒性反应。NK细胞可通过表面的活化性受体和抑制性受体与靶细胞结合而行使杀伤功能,并通过分泌颗粒酶、穿孔素、TNF及其表达Fas-L、TRAIL等方式来调节杀伤的效应。新城疫病毒NDV7793(Newcastle disease virus, NDV)分离自江西鄱阳湖的野鸭,为单股负链RNA弱毒病毒株,属于副黏病毒科Avulavirus属,它能够使禽类感染致病,而且能杀伤肿瘤细胞,但对正常的细胞无明显毒副作用,这提示NDV7793可以作为潜在的抗癌因子。我们课题组的前期研究发现NDV7793具有较强的选择性杀伤喉癌、肝癌、肺癌的作用,其杀伤活性与病毒的效价和作用时间相关；NDV7793也能够激活小鼠单核巨噬细胞,激活后的单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的能力也随之增强。在此基础上,本课题用NDV7793激活后的人NK细胞杀伤人肝癌细胞HepG2株,观察其杀伤活性,初步探讨NK细胞的杀伤活性是否与其表达的TRAIL、TNF-α、IFN-γ等有关,从而阐明NDV7793体外激活人NK细胞对人肝癌HepG2细胞的可能杀伤机制。研究目的初步阐明NDV7793体外激活人NK细胞对人肝癌HepG2细胞的可能杀伤机制。研究内容和方法应用免疫磁珠阴选分离法从人外周血分选高纯度的NK细胞,然后用NDV7793体外激活NK细胞,再将激活后的NK细胞与人肝癌HepG2细胞株混合培养,用LDH微量释放法检测NK细胞对HepG2的杀伤效应；采用实时荧光定量PCR定量检测NDV7793激活前后的NK细胞TRAIL的mRNA表达水平；用流式细胞术检测不同效价的NDV7793激活NK前后细胞膜TRAIL蛋白的表达；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病毒激活前后NK细胞TNF-α与IFN-γ的分泌水平。进而探讨NDV7793激活后的NK细胞对HepG2的杀伤能力是否与NK细胞表面TRAIL上调水平及TNF-α和IFN-γ分泌量有关。最后,我们采用IFN-γ中和抗体中和IFN-γ,流式细胞术检测TRAIL蛋白表达,从而来证实TRAIL蛋白的表达是否与IFN-γ信号通路有关。研究结果1.免疫磁珠阴选法分离NK细胞,得到高纯度未活化的NK细胞,流式细胞术检测NK细胞纯度,纯度可达90.60%±1.15%；2.NDV7793能够提高NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,其杀伤效力(释放的LDH活力值)与病毒效价和病毒作用时间相关；3.实时荧光定量PCR结果表明：NDV7793能够上调NK细胞TRAILmRNA表达,表达水平与病毒效价和作用的时间相关,在NDV7793激活NK细胞4h组TRAILmRNA表达最为明显；4.流式结果示：25.6HuNDV7793刺激NK细胞不同时间点,在16h组TRAIL表达达到高峰(11.97%±0.503%)；不同效价的NDV7793刺激NK细胞16小时,其中102.4Hu NDV7793刺激组膜表面TRAIL蛋白表达最高(22.77%±1.8%);5. ELISA结果示：不同效价病毒刺激NK细胞,204.8Hu的病毒刺激NK12h组TNF-α的分泌水平达到最高峰(0.130±0.03)；204.8Hu NDV7793刺激NK细胞不同时间点,12h组TNF-α分泌水平达到高峰(0.184±0.01)；6. ELISA结果示：25.6Hu NDV7793刺激NK细胞不同时间点,16h组IFN-γ分泌水平达到高峰(2.296±0.157)；不同效价病毒刺激NK细胞,25.6Hu的病毒刺激NK16h组IFN-γ分泌水平达到高峰(2.875±0.108)；7. IFN-γ中和抗体中和试验表明,IFN-γ中和抗体能降低NK细胞膜TRAIL的表达。研究结论1.NDV7793能增强NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,杀伤机制可能与病毒提高NK细胞TNF-α、IFN-γ的分泌及细胞膜表面TRAIL蛋白的表达有关；2.NDV7793激活NK细胞后TRAIL的表达,除与IFN-γ信号通路相关外,可能还存在其他通路。

全文目录

主要中英文缩写  4-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-18
材料与方法  18-32
  一材料  18-22
    1.1 主要仪器设备  18
    1.2 主要试剂  18-20
    1.3 其他试剂的配置  20-21
    1.4 病毒与细胞株  21
    1.5 鸡胚  21
    1.6 红细胞悬液  21-22
  二方法  22-32
    本课题技术路线  22
    1 病毒的扩增与保存  22-24
    2 人肝癌Hep-G2 细胞株的培养与细胞计数  24-25
    3 抽取外周血，提取淋巴细胞，磁珠分选NK细胞过程  25-26
    4 体外普通条件下培养NK细胞，探索NK细胞的存活时间  26
    5 乳酸脱氢痺释放法检测激活后的NK细胞对HepG2细胞的杀伤作用  26-27
    6 检测病毒NDV7793激活后的NK细胞TRAIL基因水平的变化  27-29
    7 流式细胞术检测病毒激活后的NK细胞膜TRAIL蛋白的表达  29-30
    8 ELISA方法检测NDV7793作用NK细胞上清TNF-a的浓度  30
    9 ELISA方法检测NDV779 3激活NK细胞上清中IFN-y的分泌  30-31
    10 流式检测中和IFN- Y后对NDV激活的NK细胞TRAIL膜蛋白表达  31
    11 统计学方法  31-32
结果  32-46
讨论  46-49
结论  49-50
参考文献  50-55
文献综述  55-69
  参考文献  62-69
公开发表的文章  69-70
致谢  70

NDV7793体外激活人NK细胞对人肝癌HepG2细胞株杀伤机制的初步研究

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