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外周血中NK和Treg细胞的数目和功能变化对供精人工授精不良结局的影响

作　者: 路岳超
导　师: 廖爱华
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 供精人工授精自然杀伤细胞亚群自然杀伤细胞毒性 CD4~+CD25~+ Treg细胞 CD4~+CD25~+FOXP3~+ Treg细胞 NK细胞 Treg细胞 ROC曲线
分类号: R711.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

供精人工授精术(Artificial insemination with donor sperm,AID)作为治疗男性因素引起的不孕症的一线辅助生殖技术已在全球范围内广泛应用。但其周期妊娠率不足20%,分娩活产率不足13%,导致大多数接受AID治疗的妇女经历反复授精失败、生化妊娠与胚胎停育或自然流产等不良结局,严重影响她们的身心健康,同时制约了AID的发展。目前AID不良结局发生的原因尚未完全明确。大量研究表明自然杀伤(Nature killer, NK)细胞与调节性T(Regulatory T, Treg)细胞在正常妊娠的维持中发挥重要作用,其数目和/或功能失调与复发性流产、原发性不孕及子痫前期等生殖病理性疾病的发生密切相关。最新研究显示,NK、Treg细胞还与体外受精技术(In-vitro fertilization,IVF)中胚胎反复植入失败的发生有关。此外,某些NK与Treg细胞参数在生殖失败人群中可用于预测下次妊娠结局。但二者在除IVF外其它辅助生殖技术所致的生殖失败,如AID不良结局中的研究尚未见报道。本研究通过比较发生了AID不良结局的妇女与正常生育妇女未孕期外周血NK、Treg细胞的数目与功能变化,探讨NK与Treg细胞对AID不良结局发生的影响。此外,利用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)评价NK与Treg细胞数目、功能参数对AID不良结局发生的预测能力,筛选最佳预测指标,确定临界值,从而为发生AID不良结局高危人群的早期筛查及临床干预提供依据。目的探讨外周血中NK细胞亚群数目与NK细胞毒性(NK cell cytotoxicity,NKCC)的变化对AID不良结局的影响。方法以75例AID不良结局妇女为病例组,其中,实施≥4次AID均失败的对象25例(组Ⅰ),发生生化妊娠对象25例(组Ⅱ),实施AID后妊娠12周内曾发生胚胎停止发育或自然流产对象25例(组Ⅲ),以20例成功生育一次的健康妇女为对照组。收集所有对象卵泡末期外周血,采用密度梯度离心法分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC),一部分采用三色流式细胞技术检测总淋巴细胞群中CD56~+、CD56~+CD16~+与CD56~+CD16- NK细胞亚群数目;另一部分与K562细胞共培养,采用双色流式细胞技术检测NKCC。结果与正常对照相比,组Ⅱ与组Ⅲ的CD56~+ NK细胞数目明显增加(P<0.05),AID不良结局各组CD56~+CD16~+NK细胞数目均显著升高(P<0.01),但CD56~+CD16- NK细胞数目各组间无差异(P>0.05);AID不良结局各组NKCC较正常对照升高,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论卵泡末期外周血NK细胞毒性表型数目增加、NKCC增强影响AID不良结局的发生。目的探讨外周血中Treg细胞数目与功能变化对AID不良结局的影响。方法以60例AID不良结局妇女为病例组,其中,实施≥4次AID均失败的对象20例(组Ⅰ),发生生化妊娠对象20例(组Ⅱ),实施AID后妊娠12周内曾发生胚胎停止发育或自然流产对象20例(组Ⅲ),以20例成功生育一次的健康妇女为正常对照。收集所有对象卵泡末期与黄体末期外周血,采用密度梯度离心法分离PBMC,采用三色流式细胞技术检测CD4~+ T细胞亚群中CD4~+CD25~+ Treg细胞的数目和CD4~+CD25~+FOXP3~+功能表型的百分比。结果与正常对照相比,AID不良结局各组卵泡末期外周血CD4~+细胞群中CD4~+CD25~+FOXP3~+功能表型百分比均显著减少(P<0.01),而CD4~+CD25~+ Treg细胞数目各组间的差异无统计学意义(P>0.05);卵泡末期Treg细胞数目与自身黄体末期相比,正常对照组卵泡末期CD4~+CD25~+FOXP3~+功能表型的百分比显著升高(P<0.01),而AID不良结局各组月经周期内Treg功能表型百分比的差异无统计学意义(P>0.05),CD4~+CD25~+ Treg细胞数目在病例组与对照组月经周期内的变化均无统计学意义(P>0.05)。结论卵泡末期外周血中Treg细胞功能表型百分比下降与AID不良结局的发生有关;AID不良结局各组卵泡末期Treg细胞功能下降可能与月经周期中Treg细胞功能表型扩增峰的缺失相关。目的评价NK与Treg细胞数目、功能参数对AID不良结局的预测能力,筛选出最佳的预测指标,确定其临界值。方法基于前两部分的研究结果,对与AID不良结局发生相关的CD56~+、CD56~+CD16~+ NK细胞数目、NKCC与CD4~+CD25~+FOXP3~+ Treg细胞功能表型百分比进行ROC曲线分析,计算曲线下面积(Area under curve,AUC)与曲线中各点对应的灵敏度与特异度,评价各参数对AID不良结局的预测价值。结果CD56~+、CD56~+CD16~+ NK细胞数目、NKCC与CD4~+CD25~+FOXP3~+ Treg细胞功能表型百分比的AUC分别为0.76,0.77,0.82与0.77;CD56~+ NK细胞数目>16%,CD56~+CD16~+数目>12%,NKCC>10%与CD4~+CD25~+FOXP3~+百分比<2%对AID不良结局的预测均有较高灵敏度与特异度,其中NKCC>10%是最佳预测指标。结论CD56~+、CD56~+CD16~+ NK细胞数目、NKCC与CD4~+CD25~+FOXP3~+ Treg细胞功能表型百分比对AID不良结局的发生均有一定预测能力,其中NKCC>10%的预测价值最佳。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-14
引言  14-18
  参考文献  16-18
第一部分供精人工授精不良结局妇女外周血中NK 细胞数目和功能的变化  18-31
  材料与方法  18-23
  结果  23-26
  讨论  26-29
  参考文献  29-31
第二部分供精人工授精不良结局妇女外周血中Treg 细胞数目和功能的变化  31-41
  材料与方法  31-35
  结果  35-37
  讨论  37-40
  参考文献  40-41
第三部分外周血中NK 和Treg 细胞参数对AID 不良结局预测价值的研究  41-47
  材料与方法  41-42
  结果  42-43
  讨论  43-46
  参考文献  46-47
小结  47-48
综述  48-65
  参考文献  59-65
附录硕士期间发表论文目录  65-66
致谢  66

外周血中NK和Treg细胞的数目和功能变化对供精人工授精不良结局的影响

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