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全基因组二代测序及甲基化芯片法在探明肠癌患者个体化分子标记物中的应用

作　者: 方维佳
导　师: 郑树森
学　校: 浙江大学
专　业: 外科学
关键词: 肠癌 全基因组分析 生物标记物 体细胞突变 药物靶向基因 DNA甲基化 亚硫酸氢盐转化法 甲基化谱
分类号: R735.34
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大肠癌是全世界范围内主要致死性疾病之一,转移性结直肠癌的高发病率和较差预后使寻求与疗效、预后密切相关的分子标记物的需求变得非常紧迫。全基因组分析可测定与疾病发生、严重性密切相关,并可导致基因功能丧失的序列改变。同时,表观遗传学修饰,如DNA甲基化,被认为在许多种恶性肿瘤中广泛存在。而亚洲大肠癌患者的甲基化状态仍有待进一步研究。在此,我们报道应用全基因组外显子区域二代测序的方法来测定关键基因的重要突变状态,以及采用全基因组甲基化芯片的方法来测定肠癌特征性的甲基化谱改变。第一部分：Ion Torrent二代测序平台对肠癌外显子区域体细胞突变的测定以及关键性药物靶向基因的筛选方法：收集福尔马林固定石蜡包埋的转移性结直肠癌患者活检标本,应用Ion AmpliSeqTM肿瘤基因列表进行检测。该列表被设计用来检测46个癌基因和抑癌基因中604个位点的739种突变。我们应用Ion的个体化基因组仪@(PGMTM)系统来运行整个反应,并且仅用到低至10纳克的DNA.之后样本经过含有最新版Ampliseq变异识别插件的Ion Torrent软件包分析。Ingenuity软件被用于信号通路分析。Cox回归被用来分析有效率,无病生存时间,总生存时间等临床因素和突变数量的潜在关系。结果：(1)在10例标本中,我们在根据dbSNP数据库剔除了正常突变后,共在24个基因中发现了65个异常突变。其中35%的突变基因可以在COSMIC数据库(癌症体细胞突变目录)中找到。经过单因素回归分析,并未发现任何临床因素和患者的突变数量有关。(2)值得注意的是,有包括意料之中的APC, BRAF, KRAS, PK3CA和TP53等基因在内的11个基因,每个基因至少在2个样本中有表达。Ingenuity信号通路分析证明了“结直肠癌转移信号通路“是主要的固有突变途径。分析更进一步揭示了显著活跃的包括Wnt, PI3K/AKT和TGF-beta/SMAD等在内的经典信号通路及其突变的基因。(3)有趣的是,90%的样本含有至少一个可以被作为药靶的基因突变(1到6个不等),而所有该类型突变均有相应的靶向药物或正在进行临床试验的新型靶向治疗的选择。这些药物和靶向基因的组合包括：vemurafenib和BRAF;西妥昔单抗和表皮生长因子受体；palifermin和FGFR2; pazopanib和FGFR3;AEE788和KDR以及BEZ235和PIK3CA..第二部分：Illumina的HumanMethylation27芯片平台对肠癌DNA甲基化谱的测定以及显著异常甲基化基因的筛选方法：肿瘤以及相对应的正常癌旁组织由大肠癌患者手术标本获取。基因组DNA被分离并进行亚硫酸氢盐转化。此后即以Illumina公司的Infinium HumanMethylation27BeadChip平台进行DNA甲基化谱的比较分析。结果：(1)两个肠癌标本中分别发现了258个和74个,与相应的正常癌旁组织相比,异常甲基化的基因。CMTM2, ECRG4和SH3GL3等三个基因被发现其高甲基化位点在启动子区域,而该三个基因已被前期研究证明与大肠癌生物学行为密切相关。(2)在应用热图聚类分析后,发现有8个高甲基化和10个低甲基化基因在肿瘤组织中达到了显著不同于正常癌旁组织的表观遗传学状态改变。结论：(1)对于癌基因和抑癌基因的二代测序,可在单个结直肠癌患者中探明宜作为药物作用靶点的一个或多个关键突变,凸显了该技术在肿瘤个体化治疗时代的巨大优势和广阔前景。(2)对肿瘤细胞的快速和同时性全基因组甲基化谱分析可以灵敏的发现甲基化生物标记,为特异性诊断和预后判断服务。我们的研究显示了现代甲基化高通量芯片技术在探明肠癌潜在甲基化生物标记方面可能发挥的重要作用。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-14
缩略词表  14-17
目次  17-18
引言  18-22
第一部分 Ion Torrent二代测序平台对肠癌外显子区域体细胞突变的测定以及关键性药物靶向基因的筛选  22-75
  1 前言  22-24
  2 仪器,试剂和方法  24-38
  3 结果  38-64
  4 讨论  64-74
  5 结论  74-75
第二部分 Illumina的HumanMethylation27芯片平台对肠癌DNA甲基化谱的测定以及显著异常甲基化基因的筛选  75-109
  1 前言  75-77
  2 仪器,试剂和方法  77-84
  3 结果  84-106
  4 讨论  106-108
  5 结论  108-109
参考文献  109-126
综述  126-154
  参考文献  143-154
作者简历及在学期间所取得的科研成果  154-155

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 大肠肿瘤
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