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MiR-196a调控p27~(kip1)促进胃癌细胞增殖的机制研究

作　者: 孙明
导　师: 德伟
学　校: 南京医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胃癌 miRNA miR-196a p27kip1 细胞增殖
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


胃癌的发生是一个多步骤的过程，涉及原癌基因、抑癌基因的突变及表观遗传学改变。研究发现miRNA通过调控靶基因参与相关的信号通路影响肿瘤的发生、侵袭、转移等过程，发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用。新近大量的研究报道miR-196a在多种肿瘤中出现表达紊乱，但是其在胃癌中的表达情况、发挥的生物学功能、调控的靶基因及具体的分子机制尚无明确报道。本课题组首先通过定量PCR检测miR-196a在胃癌组织及细胞系中的表达量，并进一步通过在胃癌细胞系SGC-7901中转染miR-196a的inhibitors，mimics或pCDNA/miR-196a真核表达载体，外源性封闭或过表达miR-196a，进而利用MTT，流式细胞检测技术，生物信息学分析，荧光素酶报告基因及WesternBlotting等技术检测上调或下调miR-196a对细胞增殖功能的影响及其调控的靶基因。结果显示相对于胃正常粘膜组织miR-196a的表达在胃癌组织中出现了显著的表达上调，并且其表达量与胃癌病人的肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及术后生存期等密切相关。外源性的下调miR-196a的表达能显著阻滞胃癌细胞的周期进程，抑制胃癌细胞的增殖及克隆形成能力，而上调miR-196a的表达则能显著促进胃癌细胞的周期进程、增殖及克隆形成能力，但miR-196a对胃癌细胞的凋亡并无影响。同时活体动物实验证实miR-196a的表达上调能显著促进肿瘤的形成能力。荧光素酶结果证实p27kip1是miR-196a的靶基因，定量PCR及WB结果显示miR-196a能同时下调p27kip1的mRNA及蛋白质表达水平，且上调miR-196a的表达能拮抗p27kip1抑制胃癌细胞的增殖能力。本课题组的研究结果证实胃癌细胞中上调的miR-196a抑制了p27kip1的表达，从而促进了胃癌细胞的恶性增殖及胃癌的发生、发展，提示miR-196a及p27kip1可作为未来临床治疗胃癌的新的分子靶标及胃癌治疗的预后指标。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
前言  9-14
1. 实验材料与仪器  14-16
  1.1. 实验动物  14
  1.2. 细胞系  14
  1.3. 胃癌组织标本  14
  1.4. 实验试剂  14-15
  1.5. 实验仪器  15-16
2. 实验方法  16-33
  2.1. 细胞培养  16
  2.2. 总 RNA 的提取  16-18
  2.3. 实时定量 PCR  18-20
  2.4. 蛋白质的提取与浓度测定  20-22
  2.5. 蛋白质免疫印迹(Western blot)  22-25
  2.6. 免疫组化  25-27
  2.7. MiR-196a inhibitors 和 mimics 的瞬时转染  27
  2.8. G418 筛选稳转细胞  27-28
  2.9. MTT 法检测细胞增殖活力  28
  2.10. 流式细胞术检测细胞周期  28-29
  2.11. Hoechst 33258 染色  29
  2.12. 流式细胞术检测细胞凋亡  29-30
  2.13. 克隆形成试验  30
  2.14. Transwell 实验检测细胞侵袭能力  30-31
  2.15. 荧光素酶实验检测 miR-196a 与靶基因 p27~(kip1)mRNA3’UTR 的结合  31-32
  2.16. 裸鼠成瘤实验  32
  2.17. 数据处理  32-33
3. 实验结果  33-50
  3.1. miR-196a 在胃癌组织中的表达显著上调  33-36
  3.2. 外源性上调或封闭胃癌细胞系中 miR-196a 的表达  36-37
  3.3. miR-196a 对细胞增殖功能及周期的影响  37-38
  3.4. miR-196a 对胃癌细胞凋亡能力的影响  38-39
  3.5. miR-196a 促进胃癌细胞的肿瘤形成能力  39-42
  3.6. p27~(kip1)是 miR-196a 的靶基因  42-44
  3.7. SGC-7901 细胞中过表达 p27~(kip1)  44-45
  3.8. p27~(kip1)对胃癌细胞增殖及周期的影响  45-46
  3.9. miR-196a 发挥癌基因的功能依赖于 p27~(kip1)的下调  46-48
  3.10. p27~(kip1)与 miR-196a 的表达水平呈负性相关  48-50
4. 讨论  50-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
综述  60-72
  参考文献  68-72
附录（二）缩略词表  72-73
附录（三）硕士期间发表文章  73-74
附件  74-79

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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