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大黄素对胃癌PRL-3表达与下游AKT、Bcl-2家族调控作用及机理研究

作　者: 孙振华
导　师: 卜平
学　校: 扬州大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 大黄素 胃癌 PRL-3 PI3K/AKT信号通路
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的和意义：胃癌是占世界高发肿瘤的第二位,占我国高发性消化道肿瘤的第一位,且发生率呈逐年上升的趋势,已成为威胁人类健康的主要杀手。单一的治疗方法往往难以取得好的疗效。如何针对患病个体实施综合性的治疗策略,一直为广大肿瘤研究学者所关注中药治疗肿瘤,具有疗效确切、副作用少,有着其它治疗方法无可比拟的优势。随着当代医学特别是医学分子生物学的进展,抑癌中药抗肿瘤的分子机制逐渐被一一揭示,这使中药的现代化及世界化成为可能。我国的药用植物资源丰富,中药的抗肿瘤活性已得到国际所公认。据统计,我国当前已对药用植物中28个科(属),3000多种以上中草药进行了抗癌筛选,其中含有抗癌活性成分的中草药约有200种左右。常见抑癌中药种类有清热解毒类中药、活血化瘀类中药、软举散结类中药、化湿利水类、扶正类中药等。现代研究发现常见抑癌机制有：(1)诱导肿瘤细胞凋亡；(2)抑制肿瘤血管的生成；(3)调控癌基因的表达；(4)提高机体免疫功能,下调免疫抑制分子并影响其免疫抑制效应的发挥；(5)逆转肿瘤的多药耐药性等。依据抑癌中药的作用机制及作用靶点,有的放夭的去治疗肿瘤,也为肿瘤的治疗开拓了新的思路。大黄素(1’3’8-三羟基-6-甲基葸醌),是蓼科植物虎杖的干燥根茎和根。其除了具有抗菌、止咳、降血压作用外,还有着抗肿瘤作用。但其抗肿瘤机制研究不够深入。我们研究了大黄素对人胃腺癌SGC-7901细胞株细胞抑制及凋亡、PRL-3癌基因表达调控的影响；Wan gH等人通过研究发现,PRL-3可以作为PI3K/AKT通路的上游调节分子,并在肿瘤转移、上皮-间质转化中发挥重要的作用。我们继续探讨了大黄素对胃腺癌SGC-7901细胞PI3K/AKT信号转导的影响,分析了其发挥抑癌作用的可能分子机制。方法：1、取对数生长期的SGC-7901细胞,胰蛋白酶消化后,以5×105/ml接种于96孔培养板。细胞贴壁后,更换含大黄素培养基,使得实验组含不同浓度大黄素,对照组加等量培养基,内含与最高浓度组等量的DMSO;每个浓度设8个复孔。置5%CO2培养箱内分别培养24、48、72h后,每孔加入20μ1浓度为5mg/ml的MTT。继续培养4h后弃全部上清夜,每孔加DMSO200μl,37℃震荡孵育10mmin。用酶标仪检测A570nm的OD值,计算细胞存活率及大黄素对细胞增殖的抑制率,实验重复3次。2、将不同浓度的大黄素作用于体外培养的SGC-7901细胞24小时后,胰蛋白酶消化,PBS离心洗涤收集,稀释至106/ml,以PBS重悬细胞,与适当比例的吖啶橙/溴化乙啶荧光染液混合,在荧光显微镜下观察细胞凋亡形态并分别计数早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、非凋亡的坏死细胞、活细胞,统计肿瘤细胞的凋亡率3、将不同浓度的大黄素作用于体外培养的SGC-7901细胞24小时后,胰蛋白酶消化,调整待侧细胞的密度为5×105-1×106个/ml, PBS洗涤,将细胞重悬于200μ1结合缓冲液,加入适当比例的Annexin-V-FITC和PI,混匀室温反应15min后流式细胞仪检测早期凋亡细胞率。4、利用实时荧光定量PCR仪,分析52例胃癌患者肿瘤组织及配对癌旁组织标本中的PRL-3mRNA表达情况,了解PRL-3mRNA在胃癌肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异。5、利用免疫印迹技术,分析52例胃癌患者肿瘤组织及配对癌旁组织标本中的PRL-3蛋白表达情况,了解PRL-3蛋白在胃癌肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异是否与mRNA一致。6、通过实时荧光定量PCR分析及免疫组化方法,从转录水平及翻译水平检测PRL-3、 Bmi-1在胃癌中的表达,了解其表达水平与临床病理特征的关系,分析其临床意义；7、大黄素作用于胃癌SGC-7901细胞24h后,收集细胞,分别提取RNA及细胞内总蛋白,检测大黄素作用前后PRL-3mRNA及蛋白水平的变化,分析大黄素对PRL-3表达调控的影响；8、分析大黄素作用于胃癌SGC-7901细胞24h后,PI3K/AKT通路相关蛋白及其下游分子表达的变化,探讨大黄素的可能抗肿瘤机制。结果：1、MTT法检测大黄素抑制SGC-7901增殖的实验结果显示：大黄素抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖呈时间、浓度依赖性。不同浓度大黄素作用于胃癌细胞24、48、72小时后,与对照组相比,细胞生存率显著降低(P<0.01)；除30μM浓度组与45μM浓度组在24小时段相比P<0.05外,其余组间差异明显(P<0.01)。各浓度大黄素组随着作用时间的延长,细胞生存率也显著性下降,组间比较有统计学意义(P<0.01)。2、通过AO-EB染色法在荧光显微镜下观察大黄素作用于SGC-7901细胞,结果表明：作用24小时后对照组及15μM、30μM、45μM、60μM大黄素组的细胞凋亡率(%)分别为4.05±1.06、14.79±1.23、27.84±3.30、35.15±2.59、43.63±2.33；与对照组相比,统计学差异有显著性(P<0.01)。3、流式细胞仪Annexin-V-FITC法检测不同浓度的大黄素作用于SGC-7901细胞,结果表明：作用24小时后对照组及15μM、30μM、45μM、60μM大黄素组的早期凋亡细胞率(%)分别为3.52±1.05、11.63±1.54、23.58±3.14、30.45±2.96、37.25±2.06；实验组与对照组相比,统计学差异有显著性(P<0.01)。4、52例胃癌及配对癌旁组织均可检出PRL-3mRNA的表达,胃癌肿瘤组织中PRL-3mRNA的相对表达量为2.57%±2.31%,癌旁组织中PRL-3mRNA的相对表达量为0.53%±0.42%,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。5、胃癌肿瘤组织中PRL-3蛋白表达相对于内参照的比值为0.79±0.12,癌旁组织中PRL-3蛋白表达相对于内参照的比值为0.28±0.05,两者相比差异有统计学意义(P<0.01)。6、PRL-3及Bmi-1mRNA相对表达水平在肿瘤≥5cm的胃癌组织中均高于<5cm的胃癌组织；在Ⅲ+Ⅳ期的胃癌组织中均高于Ⅰ+Ⅱ期的胃癌组织；在有淋巴结转移的胃癌组织中均高于无淋巴结转移的胃癌组织；在浸润至胃壁浆膜层或浆膜层以外的肿瘤组织中均高于浆膜层以下浸润的胃癌组织；但与患者的性别、年龄无关(P>0.05)。另外PRL-3mRNA相对表达水平在低分化胃癌组织中高于中、高分化胃癌组织(P<0.01),而Bmi-1mRNA没有表达差异(P>0.05)。肿瘤组织中PRL-3mRNA与Bmi-1mRNA的表达呈正相关(r=0.653,P<0.05)。7.胃癌组织的PRL-3及Bmi-1表达阳性染色位于细胞膜/浆,呈棕色或棕褐色沉淀,点片状分布,细胞核无染色。PRL-3蛋白在胃癌的表达与性别、年龄、肿瘤大小和分化程度均无相关性(P>0.05),与胃癌的TNM分期有相关性(P<0.05),与浸润深度、淋巴结转移有显著相关性(P<0.01)。Bmi-1蛋白在胃癌的表达与性别、年龄和分化程度均无相关性(P>0.05),与胃癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移有相关性(P<0.05),与肿瘤大小有显著相关性(P<0.01)。8、大黄素作用组可以下调PRL-3mRNA表达,与对照组相比,15μM大黄素组下调率为32.47%,60μM大黄素组下调率为87.72%,在15-60μM范围内呈浓度相关性,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。9、PRL-3在人胃癌细胞系有表达,且不同浓度的大黄素作用细胞后,随着药物浓度的增加,PRL-3蛋白表达不同水平的下调,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)10、大黄素可以下调pAKT (Thr308)及pAKT (Ser473)蛋白表达水平,与对照组相比,有统计学意义(P<0.01)；而总AKT蛋白表达水平无明显变化。11、与对照组比较,不同浓度的大黄素作用于细胞后,随着药物浓度的增加,与对照组比较Bax蛋白表达均有不同水平的上调,Bcl-2蛋白表达均有不同水平的下调,Bax/Bcl-2比率逐渐增高,其中30μM、45μM、60μM大黄素组与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。结论：1、大黄素对SGC-7901细胞体外增殖有抑制作用,并呈时间、浓度依赖性；大黄素体外可以诱导SGC-7901细胞的凋亡,提示大黄素抑制胃癌细胞生长的作用可能是通过促进胃癌细胞的凋亡而实现的；2、PRL-3mRNA及其蛋白在胃癌肿瘤组织中的表达均高于配对癌旁组织中的表达,提示PRL-3与胃癌的发生发展密切联系；PRL-3的高表达与胃癌的侵袭和发展相关；3、PRL-3在胃癌中表达水平的分析及其与Bmi-1联合检测可作为早期诊断胃癌、评估胃癌发展、了解胃癌转移及预后的分子水平参考指标；4、大黄素在抑制SGC-7901细胞的增殖、促进胃癌细胞凋亡过程中,PRL-3mRNA及蛋白水平表达下降,提示该基因的表达调控可能为大黄素抗肿瘤的作用靶点之一。5、大黄素调控PI3K/AKT信号通路中相关信号分子蛋白的表达,参与了促进胃癌细胞凋亡的机制。

全文目录


中文摘要  2-6
ABSTRACT  6-13
符号说明  13-14
前言  14-17
第一部分 大黄素对人胃腺癌细胞增殖抑制及机制研究  17-27
  一、大黄素对人胃腺癌细胞增殖的影响  17-21
    1 材料和方法  17-20
    2 结果  20-21
  二、AO-EB荧光染色观察细胞凋亡  21-24
    1 材料和方法  21-22
    2 结果  22-24
  三、流式细胞仪检测细胞凋亡  24-27
    1 材料和方法  24-25
    2 结果  25-27
第二部分 大黄素对胃癌细胞PRL-3表达调控的研究  27-59
  一、PRL-3在胃癌及癌旁组织中的表达及差异  27-36
    1 材料和方法  27-34
    2 结果  34-36
  二、PRL-3与Bmi-1在胃癌中联合表达的相关性及其临床意义  36-51
    1 材料和方法  36-39
    2 结果  39-51
  三、大黄素对胃癌SGC-7901细胞株PRL-3表达水平的调控  51-59
    1 材料和方法  51-56
    2 结果  56-59
第三部分 大黄素对PI3K/AKT通路及下游Bcl-2家族调控的研究  59-64
  1 材料和方法  59-61
  2 结果  61-64
讨论  64-68
结论  68-69
参考文献  69-72
综述  72-78
  参考文献  76-78
临床训练小结  78-79
致谢  79-80
攻读博士学位期间发表的论文  80-81

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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