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Calreticulin蛋白在食管癌转移中作用机制研究

作　者: 汪晓敏
导　师: 王明荣
学　校: 北京协和医学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CRT PTP1B Stat5a 食管鳞癌 肿瘤转移 细胞运动
分类号: R735.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


食管癌的死亡率在我国恶性肿瘤中居第四位,鳞状细胞癌是我国食管癌的主要病理类型。为了寻找与食管癌发生发展相关的分子变化,本课题组前期利用双向电泳结合质谱技术分析了食管鳞状细胞癌与癌旁正常食管上皮组织的蛋白差异表达谱发现Calreticulin蛋白在食管癌组织中表达升高,且Calreticulin蛋白高表达食管癌患者的五年生存率低于Calreticulin低表达患者。Calreticulin (CRT)是一个多功能的钙离子结合蛋白,参与蛋白质折叠、内质网钙离子的贮存和释放等多种细胞生命过程。对该蛋白在食管癌细胞中的作用进行深入研究显示,敲降CRT可抑制细胞运动穿膜和Matrigel侵袭能力。论文旨在寻找CRT下游调节基因,揭示CRT在促进食管癌细胞运动侵袭中的分子机制。我们首先在食管鳞癌KYSE150细胞系中敲降CRT,用cDNA表达谱芯片分析敲降组与对照组相比转录水平改变的分子。Realtime PCR和Western blot结果显示,敲降CRT后PTP1B在mRNA和蛋白水平均下调。在CRT缺失的细胞系中转染pcDNA3.1-CRT (mutant)回复CRT表达,PTP1B mRNA和蛋白也随之上调。本研究结果显示,CRT通过调节PTP1B转录影响其表达。在食管癌KYSE150细胞系中,敲降PTP1B后,细胞侵袭运动能力减弱,黏附和凋亡能力不受影响。在CRT敲降细胞系中感染Lenti-PTPIB,可逆转由CRT敲降导致的PTP1B降低,PTP1B可以恢复由于CRT降低导致的细胞运动侵袭抑制。体内实验显示,敲降CRT、PTP1B均可抑制食管癌肺转移。为了进一步研究CRT对PTP1B的调控机制,我们通过生物信息学分析了PTP1B基因上游启动子序列,发现存在多个Stat5a的保守结合位点。实验显示降低CRT蛋白表达后,可以抑制Stat5a(Tyr694)的磷酸化水平。染色质免疫沉淀实验显示,Stat5a结合于PTiP1B基因上游-676到-595位的TT(N)5AA保守序列。提示CRT可以作为上游分子,通过CRT-Stat5a-PTP1B途径调节PTP1B基因的转录。MMPs家族在肿瘤转移中发挥重要作用,MMP-9是其家族成员之一。我们研究发现CRT和PTP1B均可以调节MMP-9表达,且CRT敲降细胞外源感染Lenti-PTP1B,MMP-9回复升高。Erk1/2为MMP-9转录因子之一,我们验证了在KYSE150细胞系中Erk1/2可以调控MMP-9转录,而CRT通过PTP1B影响Erk1/2磷酸化水平,从而影响其活性,调节MMP-9表达。本研究揭示了在食管癌细胞中CRT通过Stat5a调控PTP1B蛋白表达,并进一步通过PTP1B增强细胞运动侵袭能力。CRT通过调节PTP1B影响Erk1/2活性,进而调控MMP9表达,影响细胞运动侵袭。这些结果为进一步阐明CRT及PTP1B在食管癌转移中的作用机制提供了新的重要线索。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
材料和方法  11-36
  一、实验材料  11-24
  二、实验方法  24-36
结果  36-58
  1、CRT下游蛋白的筛选  36-37
  2、CRT调节PTP1B表达  37-39
    2.1 CRT siRNA降低PTP1B蛋白表达  37-38
    2.2 PTP1B siRNA不影响CRT蛋白表达  38-39
  3. CRT通过PTP1B调节食管癌细胞运动和侵袭  39-45
    3.1 PTP1B siRNA对食管癌细胞运动和侵袭能力的影响  39-41
    3.2 抑制PTP1B表达对食管癌细胞生长的影响  41
    3.3 过表达PTP1B蛋白增强CRT sh食管癌细胞的运动和侵袭能力  41-44
    3.4 过表达PTP1B蛋白对CRT sh食管癌细胞生长的影响  44-45
  4. CRT和PTP1B对KYSE150细胞SCID鼠肺转移的影响  45-47
  5. CRT和PTP1B影响KYSE150细胞运动和侵袭的分子机制  47-49
    5.1 CRT siRNA通过下调PTP1B,抑制MMP-9 mRNA表达  47-48
    5.2 Erk1/2调节MMP-9基因的转录  48
    5.3 CRT通过PTP1B调节Erk1/2活性  48-49
  6. CRT调节PTP1B的分子机制  49-54
    6.1 CRT siRNA抑制Stat5a转录活性  49-50
    6.2 Stat5a调节PTP1B基因的转录  50-52
    6.3 CRT通过Stat5a调节PTP1B表达  52-54
  7. PTP1B在食管癌组织中表达升高  54-55
  8. 在食管癌组织中CRT和PTP1B表达存在相关性  55-58
讨论  58-65
  1. CRT对多个基因发挥调控作用  58-59
  2. CRT通过调节PTP1B表达促进食管癌细胞运动和侵袭  59-60
  3. CRT通过调节Stat5a活性,促进PTP1B表达  60-62
    3.1 CRT调节Stat5a转录活性  60-62
    3.2 Stat5a对PTP1B蛋白表达的调节  62
  4. CRT通过PTP1B影响MMP-9表达  62-63
  5. CRT和PTP1B通过Erk调节MMP-9表达  63-65
小结  65-66
论文综述  66-73
参考文献  73-80
致谢  80-82
基金资助  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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