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利用IL-8启动子报告基因分析平台筛选具有抑制肺癌微环境分泌IL-8能力的单体

作　者: 钱单东
导　师: 李引乾
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 肺腺癌白细胞介素-8 微环境肿瘤侵润的巨噬细胞血管新生
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：研究发现IL-8与肿瘤的血管新生有紧密的相关性，进一步影响到肿瘤病人的存活率。在肺癌组织细胞中，寻找具有抑制肺癌相关细胞分泌IL-8能力的天然产物单体。以期找到能够使IL-8表达量下降的中草药成分，影响癌细胞的生长和转移，进而找到一种免疫调节剂，调节肿瘤生长的微环境，缓解肿瘤的发展。方法：首先，将IL-8启动子构建的pGL-3basic质粒转染到HEK293细胞中，过4h用IC20浓度的的天然化合物单体处理24h。紧接着通过报告基因分析系统测其荧光值。然后用MTT方法进行不同的天然化合物单体在HEK293种细胞株中的细胞毒性初步了解。用筛选出的2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮（简称查尔酮）分别处理CL1-0、CL1-5、THP-1三种细胞。研究分析该化合物对以上三类细胞各自表达IL-8的影响。采用实时定量PCR、ELISA、报告基因分析方法，来检测各细胞中IL-8的表达量同时利用EMSA分析其调控机制。结果：1.药物筛选结果在HEK293细胞中，经过筛选得到13种能够抑制IL-8产物的单体，其中主要包括芝麻素和2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮两种主要天然产物单体。2. CL1-0细胞中IL-8启动子活性检测结果2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮具有很好的抑制IL-8启动子的能力。其抑制效果达到50%。3. IL-8mRNA水平检测结果通过2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮处理过的CL1-5细胞其IL-8mRNA水平明显提高。其增强表达的效果达到30%。4. IL-8上游调控机制分析结果经过2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮处理的CL1-5细胞，发现作为IL-8转录因子的AP-1和NF-κB与IL-8上游启动子的结合位点的结合能力明显提高。5.细胞培养液中IL-8溶度检测结果肿瘤相关巨噬细胞THP-1经过2’,4’-二羟基-4’,6’-二甲氧基查尔酮处理，其分泌IL-8能力具有下降的现象。其抑制表达效果达到24.9%。结论：1.查尔酮对于初期的肺癌细胞和肿瘤相关的巨噬细胞具有正面作用——能够抑制CL1-0和肿瘤相关巨噬细胞THP-1分泌IL-8的能力。建议在肿瘤早期可以通过该化合物调节炎症因子IL-8的释放，从而调节肿瘤细胞生长的微环境，达到缓解肺癌生长的目的。2.查尔酮对于恶化程度较高的肺腺癌肿瘤细胞CL1-5具有负面作用——能够提高CL1-5细胞分泌IL-8的能力。即使与肿瘤相关巨噬细胞作用相反，肿瘤自身的自分泌和旁分泌作用不能小视，所以不建议在在晚期的肺癌肿瘤细胞中使用。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章 IL-8 在肿瘤细胞及其微环境中的作用  13-24
  1.1 前言  13
  1.2 IL-8 研究概况  13-15
  1.3 IL-8 与肿瘤血管新生的关系  15-17
  1.4 IL-8 在肿瘤中表达的调控  17-19
  1.5 肿瘤 IL-8 的表达与肿瘤的关系  19-20
  1.6 肿瘤细胞与微环境基质细胞相互作用  20-23
  1.7 小结  23-24
第二章利用报告基因平台进行候选药物的前期筛选  24-32
  2.1 材料与方法  24-27
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 方法  24-27
  2.2 结果与分析  27-30
  2.3 讨论  30-31
    2.3.1 HEK293 细胞株的特点  30-31
    2.3.2 磷酸钙转染真核细胞的影响因素  31
    2.3.3 数据处理方法  31
  2.4 小结  31-32
第三章利用 MTT 法确定查尔酮对肿瘤细胞试验最佳试验溶度  32-36
  3.1 材料与方法  32-34
  3.2 结果与分析  34-35
  3.3 讨论  35
    3.3.1 实验药物浓度选定  35
    3.3.2 实验数据分析  35
  3.4 小结  35-36
第四章查尔酮对 CL1-0 分泌 IL-8 能力影响  36-40
  4.1 材料与方法  36-38
    4.1.1 材料  36
    4.1.2 方法  36-38
  4.2 结果与分析  38
  4.3 讨论  38-39
    4.3.1 采用报告基因系统的考虑  38-39
    4.3.2 Lipofectamine TM 2000 方法的主要影响因素  39
  4.4 小结  39-40
第五章查尔酮对 CL1-5 分泌 IL-8 能力影响  40-44
  5.1 材料与方法  40-42
    5.1.1 材料  40
    5.1.2 方法  40-42
  5.2 结果与分析  42-43
  5.3 讨论  43
    5.3.1 CL1-5 细胞株特点  43
    5.3.2 荧光染料选择  43
  5.4 结论  43-44
第六章查尔酮增加 CL1-5 分泌 IL-8 的机制初探  44-48
  6.1 材料与方法  44-46
    6.1.1 材料  44
    6.1.2 方法  44-46
  6.2 结果与分析  46-47
  6.3 讨论  47
    6.3.1 EMSA 实验的主要影响因素  47
    6.3.2 实验设计考虑  47
  6.4 小结  47-48
第七章查尔酮对肿瘤相关巨噬细胞分泌 IL-8 的影响  48-52
  7.1 材料与方法  48-50
    7.1.1 材料  48-49
    7.1.2 方法  49-50
  7.2 结果与分析  50-51
  7.3 讨论  51
    7.3.1 THP-1 细胞的特点  51
    7.3.2 ELISA 方法的主要影响因素  51
    7.3.3 数据处理方法  51
  7.4 小结  51-52
结论  52-53
参考文献  53-62
附录  62-67
缩略词  67-69
致谢  69-70
作者简介  70

利用IL-8启动子报告基因分析平台筛选具有抑制肺癌微环境分泌IL-8能力的单体

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