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肺腺癌细胞总RNA转染树突状细胞诱导特异性CTL的体内抗肿瘤效应研究

作　者: 蔡秋妍
导　师: 王保龙
学　校: 安徽医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 树突状细胞 细胞毒 T 淋巴细胞 肺腺癌 裸鼠
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：针对肺腺癌缺少已知肿瘤抗原和晚期患者肿瘤组织来源困难两大难题，利用建系的肿瘤细胞株与活体组织肿瘤细胞有共享肿瘤抗原的特点，自行构建RNA-DCs疫苗，诱导产生肺腺癌抗原特异性的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes,CTLs)，探讨其对肺腺癌移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法：(1)从外周血单个核细胞(PBMCs)中诱导产生DCs，提取人肺腺癌细胞株A549总RNA电转染DCs，转染后的DCs与自体T淋巴细胞混合培养，诱导产生人肺腺癌抗原特异性的CTL(RNA-DCs-CTL)。(2)实验分为转染RNA的DCs组（RNA-DCs）、转染PBS的DCs组(PBS-DCs)和未转染DCs组(N-DCs)，流式细胞术(FCM)测定混合淋巴细胞培养后不同组别CD8+T细胞比例，RT-PCR证明总RNA转染效率，3H-TdR掺入检测T细胞增殖指数以及乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定杀伤肿瘤活性。(3)建立肺腺癌细胞株A549荷瘤裸鼠模型，过继回输混合培养后的T细胞，比较不同组别肿瘤体积的差异，计算抑瘤率，免疫组化法检测移植瘤组织中Bax、Bcl-2、COX-2和VEGF的表达，并用全自动图像分析系统分析其平均光密度值(mean optical density, MOD)。结果：(1) RNA-DCs和自体T细胞共培养后CD8+T细胞大量增殖，与PBS-DCs和N-DCs组相比差异显著(P<0.05)。(2) RT-PCR证明电穿孔法可成功使A549的总RNA转染入DCs并可使DCs表达肿瘤抗原。(3) RNA-DCs可显著刺激自体T淋巴细胞增殖，并且诱导产生肿瘤特异性CTLs，对A549细胞产生特异性杀伤作用，而PBS转染组与未转染组则无明显作用（P<0.05）。3H-TdR液闪法测得各组的cpm值分别为：阳性对照组（ConA+T细胞）：17105±130，RNA-DCs组：7759±493，PBS-DCs组：2611±161， N-DCs组：2248±332，差异有统计学意义(P<0.05)；(3)成功建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型。过继回输RNA-DCs-CTL组裸鼠荷瘤体积明显小于回输PBS-DCs-T和N-DCs-T组(P<0.05)，抑瘤率分别为68.53%和8.62%；(4)RNA-DCs-CTL治疗后，肿瘤组织Bax的表达显著上调，COX-2、Bcl-2和VEGF的表达显著下调。结论：1.人肺腺癌细胞细胞株A549总RNA转染DCs诱导产生的抗原特异性CTL（A549-RNA-DCs-CTL）对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用。2.除了细胞毒性作用外，A549-RNA-DCs-CTL的抗肿瘤作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关。

全文目录


英文缩略词表  5-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-12
2 材料和仪器  12-16
  2.1 研究对象  12-13
  2.2 细胞株来源  13
  2.3 实验动物  13
  2.4 试剂和仪器  13-15
  2.5 实验器材  15
  2.6 溶液的配制  15-16
3 实验方法  16-29
  3.1 A549 细胞培养  16-17
  3.2 A549 细胞总 RNA 提取  17-20
  3.3 外周血干细胞采集物单个核细胞的制备  20
  3.4 DCs 的培养  20-21
  3.5 DCs 的转染  21
  3.6 流式细胞仪检测 DCs 表面标志  21-22
  3.7 RT-PCR 法检测 DC 的转染效率  22-24
  3.8 自体 T 淋巴细胞的培养  24-25
  3.9 混合淋巴细胞反应（MLR）  25-26
  3.10 肿瘤抗原特异性 CTL 的诱导  26
  3.11 DC 致敏淋巴细胞后淋巴细胞表型变化的鉴定  26-27
  3.12 细胞毒性试验  27
  3.13 T 细胞的冻存和复苏  27
  3.14 荷瘤裸鼠模型的建立  27-28
  3.15 DC 活化的淋巴细胞对荷瘤裸鼠的治疗作用  28
  3.16 组织病理学观察  28
  3.17 裸鼠皮下移植瘤细胞的免疫组织化学鉴定  28-29
  3.18 统计分析  29
4 结果  29-39
  4.1 DCs 的形态学观察  29-30
  4.2 A549 总 RNA 的电泳图  30
  4.3 流式细胞仪术检测 3 组 DCs 表面标志的表达情况  30-32
  4.4 RT-PCR 检测肿瘤 RNA 转染后 DCs 的肿瘤抗原的表达  32
  4.5 MLR 观察 T 细胞增殖  32-33
  4.6 T 细胞表面分子的表达  33-34
  4.7 细胞毒性试验  34-35
  4.8 移植瘤裸鼠模型的建立  35
  4.9 肿瘤抗原特异性CTL对荷瘤裸鼠模型的治疗作用  35-37
  4.10 肿瘤组织病理改变  37-38
  4.11 Bax、Bcl-2、COX-2、VEGF的免疫组化结果  38-39
5 讨论  39-42
6 结论  42
7 参考文献  42-45
附录  45-46
致谢  46-47
综述  47-52
  参考文献  50-52

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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