血清p53抗体检测；第二部分研究内容为肿瘤微环境压力对血管生成因子ANG、VEGF和bFGF的表达调控。两个课题均为本人在博士期间所从事研究方向，二者在二级学科上均属于细胞生物学范畴。所不同的是，第一" />
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癌症患者血清p53抗体检测和肿瘤微环境压力对血管生成因子表达调控

作　者: 于得海
导　师: 王丽
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 癌症 血清p53抗体 噬菌体展示技术 ELISA ANG VEGF bFGF p53 缺氧 高密度 血清饥饿 PC-3细胞
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本论文包括两个部分：第一部分主要研究内容为癌症患者p53抗体 的学位论文">血清p53抗体检测；第二部分研究内容为肿瘤微环境压力对血管生成因子ANG、VEGF和bFGF的表达调控。两个课题均为本人在博士期间所从事研究方向，二者在二级学科上均属于细胞生物学范畴。所不同的是，第一部分属于肿瘤免疫学内容，而第二部分属于肿瘤细胞生物学内容，两方面在具体研究内容上并无直接联系，因此分部进行阐述。是作说明。第一部分癌症患者血清p53抗体检测由于肿瘤在发生之初并没有特别的症状表现，导致很多癌症患者在被确诊罹患癌症的时候，已经处于晚期并丧失了治愈的机会。事实上，有很多方法可以改变目前肿瘤预防和诊疗所处的尴尬局面，以达到“早发现，早治疗”的目的。肿瘤标志物的检测正是这样的一种方法。血清p53抗体（s-p53Ab）是被证明与p53基因突变和p53蛋白积累密切相关，是一种具有潜在应用价值的肿瘤特异性血清标准物。监测s-p53Ab的表达规律可能从一个侧面反映肿瘤发生、发展和恶化的情况以及肿瘤对某些抗癌药物的耐药性。目前，检测s-p53Ab的最常用的方法是酶联免疫吸附法（ELISA），但是传统ELISA方法检出率有待提高，而且所采用的抗原多是原核表达纯化后的重组型p53蛋白，其结构与人体内天然蛋白的结构存在差异，这可能导致在检测的时候出现漏检或假阴性的现象。此外，蛋白制备和纯化工艺复杂，成本较高。噬菌体展示技术能在噬菌体的表面展示特定蛋白质或多肽。这种展示的多肽能很好的模拟天然蛋白表位构象，具有灵敏度高，抗原性强等特点。而且无需经过特殊纯化工艺，制备成本极低。在本实验中，我们创新性地将以重组型蛋白为抗原建立的p53-ELISA和以杂合噬菌体为抗原的phage-ELISA联合起来，既发挥了p53-ELISA的抗原多表位、灵敏度高的特点，又融合了phage-ELISA抗原单表位、特异性高的特点。我们用p53-ELISA和phage-ELISA联合检测了829名包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌、肝癌和卵巢癌的癌症患者s-p53Ab表达情况。结果显示，在各类癌症患者中，s-p53Ab阳性率最高的是卵巢癌，最低的是肝癌。p53-ELISA的检出率为25.6%(212例)，phage-ELISA的检出率为19.9%(165例)，而p53-phage-ELISA的联合检出率达到35.9%(298例)；s-p53Ab水平与癌症患者淋巴结转移和肿瘤分期等诸多临床病理参数有关。此外，我们发现非小细胞肺癌患者随着化疗结束后症状的缓解，s-p53Ab的表达在整体上有降低的趋势，s-p53Ab阳性患者所占比例显著降低，而那些化疗前s-p53Ab高表达的患者存在对化疗药物的耐药性，治疗效果较差。我们的研究表明，传统的ELISA方法和噬菌体展示ELISA方法具有很好的互补性，二者联合起来能够达到更好的检测效果。对s-p53Ab的监测或许能够为癌症患者临床诊断和治疗提供更好的线索。第二部分肿瘤微环境压力对血管生成因子ANG、VEGF和bFGF表达调控的初步探讨无论是还创伤修复还是肿瘤发生过程，微环境的改变通常是诱发血管产生的最原始的因素和动力，因为受到微环境变化影响的组织或细胞会应激性地产生与这种改变相抗衡的刺激信号，以弥补对自身造成的损害或朝着利于自身发展的方向前进。肿瘤细胞所处的内环境非常复杂。缺氧、细胞密度过大和营养成分的短缺是诸多微环境压力中最突出的三种。肿瘤要保证持续增殖并向远处转移，必须要靠诱导新生血管的发生来增加氧气含量，维持足够的养分。ANG，VEGF和bFGF是非常重要的血管生成因子，除了在调控细胞增殖和血管生成方面具有重要作用，彼此之间似乎也存在相互制约，协调工作的机制。但是这种制约和协调的机制目前尚不清楚，尤其是在缺氧、高密度和血清饥饿这样的条件刺激下的作用机制，更是未见报道。针对以上研究中存在的空白，本实验引入了缺氧(Hypoxia)、高密度(Highdensity)和血清饥饿(Serum starvation)条件刺激，初步探讨了上三种血管生成因子在不利环境中表达情况。我们发现在缺氧和高密度培养下，人前列腺癌细胞PC-3（p53缺失型）的ANG和VEGF的表达显著升高，而bFGF的表达显著降低；单纯提高内源性ANG或VEGF的表达量并不能介导bFGF的低表达；在PC-3细胞中转染p53表达质粒，也不能引起缺氧条件下ANG、VEGF和bFGF三者的表达变化。根据实验结果，我们预测在不良微环境中，血管生成因子之间及缺氧诱导因子(HIF)之间或许存在某种未知的反馈调节机制；此外，p53缺失型细胞血管生成因子的调控机制与其他细胞或许存在差异。我们希望这些初步的研究能为后续深入探索奠定前期工作基础，并为揭示血管生成因子在肿瘤发生和发展中的调控机制做出一些贡献。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第一部分 癌症患者血清 p53 抗体检测  11-67
  引言  11-38
    1.肿瘤标志物及其检测方法和检测意义  11-12
      1.1 我国恶性肿瘤现状严峻  11
      1.2 肿瘤的防治措施  11-12
    2.肿瘤标志物检测在肿瘤诊治中的应用  12-18
      2.1 生物学标志物和肿瘤标志物  12
      2.2 常见肿瘤标志物  12-18
    3.一种重要的肿瘤标志物——p53蛋白、p53基因及血清p53抗体  18-25
      3.1 p53发现历史——p53蛋白与猿猴病毒SV40  18-19
      3.2 “p53蛋白”作为一种原癌蛋白  19
      3.3 由原癌蛋白到抑癌蛋白的转变  19
      3.4 p53基因  19-20
      3.5 p53蛋白  20-22
      3.6 p53抗体  22-25
    4.s-p53 Ab检测在肿瘤预防和辅助诊断中的应用  25-28
      4.1 s-p53 Ab检测对肿瘤高危人群的预测作用  25-26
      4.2 s-p53 Ab与肿瘤患者临床和病理相关性  26-28
    5.噬菌体展示技术  28-35
      5.1 丝状噬菌体的结构  28-29
      5.2 丝状噬菌体的复制和装配  29-30
      5.3 丝状噬菌体展示系统  30-32
      5.4 用于展示外源多肽的载体系统  32-34
      5.5 噬菌体展示技术的优势及应用  34-35
    6.s-p53抗体检测的研究意义  35-38
      6.1 立题依据  35-36
      6.2 研究内容和研究路线流程图  36-37
      6.3 研究和意义  37-38
  实验材料与方法  38-50
    1.实验材料  38-40
      1.1 质粒和菌种  38-39
      1.2 主要生化试剂和实验器具  39
      1.3 主要实验设备和仪器  39
      1.4 癌症患者血清  39-40
    2.实验方法  40-50
      2.1 pQE40-p53 质粒提取、测序和转化  40-41
      2.2 p53 蛋白的诱导表达、纯化和复性  41-43
      2.3 p53 蛋白的抗原性鉴定  43-46
      2.4 噬菌粒载体的转化  46
      2.5 杂合噬菌体的制备和纯化  46
      2.6 杂合噬菌体抗原性鉴定  46-48
      2.7 p53-ELISA、phage-ELISA及p53-phage-ELISA检测方法的建立  48-49
      2.8 竞争ELISA分析抗原抗体结合特异性  49
      2.9 统计学方法  49-50
  实验结果与讨论  50-66
    1.实验结果  50-60
      1.1 实验室保存的pQE40-p53 质粒测序验证结果  50-51
      1.2 诱导表达及纯化复性的p53 蛋白SDS-PAGE电泳结果  51-52
      1.3 Western blot方法验证p53 蛋白抗原性  52-53
      1.4 杂合噬菌体的制备  53
      1.5 Western blot方法验证杂合噬菌体抗原性  53-54
      1.6 竞争ELISA分析抗原抗体结合特异性  54-55
      1.7 各种癌症患者p53-ELISA和phage-ELISA检测结果  55-56
      1.8 s-p53 Ab表达与部分癌患者临床病理指标相关性的分析  56-58
      1.9 非小细胞肺癌患者s-p53 Ab表达在治疗前后的变化情况分析  58-59
      1.10 s-p53 Ab的表达与化疗疗效的相关性  59-60
    2.讨论  60-66
      2.1 实验体系设计和质量控制  60-61
      2.2 实验结果分析  61-66
  主要结论和创新点  66-67
    1.主要结论  66
    2.创新点  66-67
第二部分 肿瘤微环境压力对血管生成因子ANG、VEGF和bFGF表达调控的初步探讨  67-98
  引言  67-77
    1.肿瘤血管生成及血管生成因子  67-71
      1.1 肿瘤血管生成理论的提出  67
      1.2 肿瘤血管生成过程  67-68
      1.3 几种重要的肿瘤血管生成因子  68-71
    2.微环境对血管生成因子表达的影响  71-74
      2.1 缺氧对血管生成因子的影响  71-73
      2.2 细胞密度对血管生成因子的影响  73-74
      2.3 饥饿对血管生成因子的影响  74
    3.血管生成因子之间的相互调控作用  74-75
    4.研究内容和意义  75-77
  实验材料和方法  77-84
    1.实验材料  77-78
      1.1 质粒、菌种和细胞株  77-78
      1.2 药品和试剂  78
      1.3 实验设备和仪器  78
    2.实验方法  78-84
      2.1 分子生物学实验方法  78-82
      2.2 免疫学实验方法  82
      2.3 细胞生物学实验方法  82-83
      2.4 统计学方法  83-84
  实验结果和讨论  84-97
    1.实验结果  84-93
      1.1 pcDNA3.1(-)-p53 质粒的构建  84-87
      1.2 血清饥饿和缺氧培养细胞形态学观察  87-88
      1.3 缺氧对ANG、VEGF和bFGF mRNA和蛋白表达的影响  88-90
      1.4 高密度对ANG、VEGF和bFGF mRNA表达的影响  90-91
      1.5 饥饿培养对ANG、VEGF和bFGF mRNA表达情况的影响  91-92
      1.6 p53 对ANG、VEGF和bFGF mRNA表达的影响  92-93
    2.讨论  93-97
  主要结论和创新点  97-98
    1.主要结论  97
    2.创新点  97-98
参考文献  98-118
致谢  118-119
在研期间公开发表论文  119-121
在研期间参与的科研项目  121

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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