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Kir6.2/K-ATP通道在C57BL/6J小鼠局部脑缺血再灌注损伤中的作用

作　者: 黄旭
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 脑卒中缺血再灌注损伤 ATP敏感性钾通道大脑中动脉闭塞术神经血管单元内质网应激神经再生 D型丝氨酸
分类号: R743.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

脑卒中（stroke），又称中风或脑血管意外，是一组突然起病以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，因其高发病率、高致残率、高死亡率，严重危害着人类健康，其中缺血性脑卒中占绝大部分。缺血性脑卒中后发生的再灌注损伤对卒中后神经修复与功能重建危害极大。迄今的研究已阐明脑缺血再灌注损伤中多种机制，包括：能量耗竭、胞内钙离子水平升高、兴奋性毒性、扩布性抑制、自由基大量产生、血脑屏障（brain-blood-barrier，BBB）破坏、炎症和凋亡等。虽然早期溶栓和神经元保护的研究取得了一定进展，但是旨在寻找具有减轻缺血性脑损伤作用的神经保护药物的临床试验几乎均以失败告终。因此，发现新的脑卒中神经保护靶点并据此研发理想的神经保护剂显得十分紧迫。研究表明，脑神经功能的恢复不能仅着眼于单一神经元的保护，而应关注包括神经元、星形胶质细胞以及内皮细胞在内的整个神经血管单元的保护及脑缺血后神经再生。以干细胞为基础的治疗策略为未来脑缺血后功能恢复展示了富有希望的前景。脑缺血损伤可诱发脑内两个重要神经再生相关脑区侧脑室下区（subventricularzone，SVZ）与海马齿状回颗粒细胞下区（subgranular zone，SGZ）神经再生增强，成年神经干细胞在缺血性脑损伤后能够增殖分化为神经元和胶质细胞，参与神经功能的修复过程。有效地促进脑缺血后内源性神经干细胞的增殖分化、加速神经功能重建也是目前脑卒中研究的一个重要领域。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channel，K-ATP）是一类偶联细胞代谢和电活动的非电压依赖性特殊钾离子通道。它由内向整流钾通道（inwardlyrectifying potassium channel，Kir）和磺酰脲受体（sulphonylurea receptor，SUR）亚单位以4:4组合形成异构八聚体，在体内多种组织器官均有表达。正常情况下，脑内K-ATP通道处于关闭状态，当细胞内ATP/ADP比例下调后，其可被迅速激活。既往研究发现，当局部脑血流下降，能量代谢发生障碍，细胞膜过度去极化，启动兴奋性毒性级联反应，引发钙超载，进而造成组织损伤。而K-ATP通道开放后，钾离子外流，细胞膜发生超级化，降低细胞兴奋性，从而对抗脑缺血缺氧损伤。K-ATP通道在脑内广泛分布，神经元主要表达Kir6.2亚基构成的K-ATP通道（Kir6.2-containing K-ATP channel，Kir6.2/K-ATP通道），而星形胶质细胞则主要表达Kir6.1亚基构成的K-ATP通道。已有报道Kir6.2敲除导致神经元在氧糖剥夺刺激下发生严重去极化，进而导致大量神经元凋亡和坏死，而过表达Kir6.2将有助于减轻局部缺血性脑损伤，表明K-ATP通道在抵抗急性缺血性脑损伤过程中至关重要。迄今针对K-ATP通道开放产生脑保护作用的研究大多局限于单一神经元的保护。然而，神经血管单元各组分在脑卒中病理生理机制中均发挥重要作用。我们推测：K-ATP通道开放产生的脑保护效应不仅依赖于对神经元的保护，还通过调节神经血管单元各组分的功能而发挥脑保护作用。本实验室前期研究发现神经干细胞上表达Kir6.1和SUR1构成的K-ATP通道，并发现K-ATP通道开放剂可以促进基础状态及慢性温和不可预知应激模型小鼠海马区神经再生以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）模型小鼠SVZ与SGZ区神经再生，提示K-ATP通道可以通过促进神经再生与修复，发挥神经保护作用。然而，K-ATP通道是否参与脑缺血后神经再生修复过程？至今未见报道。因此，研究、阐明Kir6.2/K-ATP通道在缺血性脑损伤后期修复中作用具有重要意义。脑内N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体共激动剂D型丝氨酸（D-Serine，D-Ser）是近年来发现的一种重要的胶质递质，参与学习记忆、衰老及多种神经精神疾病的发生过程，本实验室前期研究发现K-ATP通道开放剂能抑致MPTP慢性模型小鼠黒质星型胶质细胞D-Ser表达增加。已有文献报道脑缺血后急性期D-Ser含量显著增加，这是否与脑缺血后神经再生增强相关？D-Ser是否参与对神经干细胞功能的调节？迄今均未见报道。鉴于上述，本文第一部分工作应用Kir6.2敲除（Kir6.2knockout，Kir6.2-/-）小鼠建立缺血缺氧（大脑中动脉闭塞middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，研究Kir6.2/K-ATP通道在局部脑缺血再灌注损伤急性期中的作用，揭示表达于神经血管单元各组分上的K-ATP通道在缺血性脑损伤中的重要作用。第二部分研究Kir6.2敲除对脑缺血再灌注损伤后期神经再生修复过程的影响，阐明K-ATP通道参与脑卒中后期的修复过程。第三部分离体培养新生小鼠SVZ区神经干细胞，研究D-Ser对神经干细胞增殖、迁移、分化的调节作用及可能的分子机制，深化对中枢神经系统中D-Ser生理功能的认识，为神经退行性病和脑卒中等重要脑疾病的神经细胞替代治疗新策略的形成积累学术基础。第一部分Kir6.2/K-ATP通道对C57BL/6J小鼠脑缺血再灌注损伤急性期的作用目的：研究、阐明Kir6.2/K-ATP通道对小鼠脑缺血性再灌注损伤急性期的作用。方法：应用3月龄WT及Kir6.2-/-雄性C57小鼠，线栓法建立MCAO模型，缺血1h再灌注24h后统计死亡率并行神经功能缺陷评分；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色观察脑梗死体积变化；伊文氏蓝（Evans blue，EB）渗出法评价血脑屏障通透性的破坏；免疫组织化学法观察内皮细胞及基底膜形态学改变，观察神经元、星形胶质、小胶质细胞数量及形态学改变；Western blotting法测定热休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases9，MMP-9）、caspase-1、CHOP、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）、caspase-12的表达；Realtime-PCR法测定脑内IL-1β、 TNF-α mRNA水平，酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定脑内IL-1β、TNF-α的含量。结果：1、Kir6.2基因敲除导致小鼠MCAO术后死亡率增高，神经运动功能损伤加重，脑梗死体积增加；2、Kir6.2基因敲除加重小鼠MCAO后血脑屏障的破坏；3、Kir6.2基因敲除上调小鼠脑缺血后基质金属蛋白酶MMP-9表达，增加其底物蛋白occludin及collagen IV的降解；4、Kir6.2基因敲除加重小鼠脑缺血再灌注损伤后神经元的损伤，增强胶质细胞活化；5、Kir6.2基因敲除取消小鼠脑内保护性应激蛋白HSP70的表达上调，增强内质网应激诱导的凋亡蛋白CHOP、caspase-12的表达；6、Kir6.2基因敲除增加小鼠脑缺血后脑内炎症小体的激活及TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放。结论：Kir6.2/K-ATP通道缺失加重脑缺血损伤后神经血管单元各组分破坏，增强内质网应激及炎症小体组分的激活，从而加重脑缺血再灌注损伤。第二部分Kir6.2/K-ATP通道对C57BL/6J小鼠脑缺血再灌注损伤后神经再生的调节作用目的：研究、阐明Kir6.2/K-ATP通道在小鼠局部脑缺血再灌注损伤后期修复中的作用。方法：应用3月龄WT及Kir6.2-/-雄性C57小鼠，线栓法建立MCAO模型，在模型后第8天给予促神经再生药物氟西汀，给药（10mg/kg，腹腔注射）持续28天，比较Kir6.2敲除鼠及野生型小鼠缺血性脑损伤后神经修复过程中小鼠感觉运动功能恢复水平；神经干细胞增殖、存活及向神经元分化差异；观察此过程中胶质细胞活化和神经元损伤动态变化过程并应用高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography，HPLC）测定SVZ及海马区胶质递质D-Ser含量的动态变化。结果：1、Kir6.2基因缺失促进脑缺血再灌注损伤后长期感觉运动功能障碍的恢复；2、脑缺血损伤后神经再生增强，氟西汀可促进脑缺血后神经再生；3、Kir6.2缺失不影响神经干细胞增殖及其向神经元分化的比例，但能促进BrdU阳性细胞的存活；4、Kir6.2基因缺失取消了脑缺血再灌注后期（7周）记忆功能的降低；5、Kir6.2基因缺失减少脑缺血再灌注损伤后7周脑梗死范围并抑制胶质细胞活化；6、缺血后7天，两种基因型小鼠SVZ区D-Ser含量较伪手术组显著升高，并可维持至MCAO后21天，缺血后35天恢复至伪手术水平，而Kir6.2缺失不影响脑缺血后胶质递质D-Ser含量。结论：1、Kir6.2/K-ATP通道缺失减轻脑缺血再灌注损伤晚期的神经损伤，促进脑缺血后新生细胞的存活，减轻脑缺血损伤后记忆功能缺失，提示Kir6.2/K-ATP通道参与了脑缺血后期神经修复的调节；2、脑缺血后SVZ区D-Ser含量变化与BrdU阳性细胞增加相对应，而海马区无相应变化，提示D-Ser可能参与了脑缺血后SVZ区神经再生的调节。第三部分离体研究：D-Serine对C57BL/6J小鼠SVZ神经干细胞功能的调节目的：研究、阐明D-Ser对神经干细胞基本生物学特性的调节作用。方法：分离培养新生小鼠的神经干细胞，免疫荧光法检测细胞内D-Ser及其合成酶丝氨酸消旋酶（serine racemase，SR）的表达，HPLC检测细胞外D-Ser含量。应用D型氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）耗竭细胞外D-Ser或NMDA受体阻断剂MK-801阻断NMDA受体信号通路并外源性给予D-Ser，研究D-Ser对神经干细胞增殖、迁移、分化的影响。通过5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）掺入法分析神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖；于干细胞球种植后48小时测定NSCs放射状迁移距离；在含1%胎牛血清的培养基中培养7天后通过神经元特异性III型β-微管蛋白（neuron-specific classIII β-tubulin，Tuj-1）和GFAP（glial fibrillary acidic protein）双免疫荧光的方法测定NSCs表型分化。应用Fluo-3钙离子成像技术，研究D-Ser对NSCs钙瞬变（calcium transient）影响。进一步应用Western blotting检测耗竭细胞外D-Ser后糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）及环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的磷酸化表达变化。结果：1、NSCs存在D-Ser合成酶SR的表达，其自身能合成D-Ser并释放至胞外；2、应用DAAO耗竭细胞外D-Ser能显著抑制NSCs增殖及其向神经元的分化，但对NSCs放射状迁移无显著影响；3、外源性给予D-Ser对NSCs增殖无显著影响；高浓度D-Ser能显著改善DAAO或MK-801对新生神经干细胞增殖的抑制作用，促进NSCs向神经元的分化；4、DAAO耗竭胞外D-Ser可以抑制谷氨酸对NSCs诱导的钙瞬变幅度；5、DAAO抑制神经干细胞中磷酸化GSK3β，ERK1/2及CREB表达。结论：NSCs能自身合成并释放D-Ser，通过作用于NMDA受体、进而影响胞内钙离子浓度，从而调节NSCs的增殖及其向神经元的分化，其分子机制与维持GSK-3β、ERK1/2及下游CREB的磷酸化有关。综上所述，本研究工作的主要创新之处在于：1. Kir6.2/K-ATP通道是缺血性脑损伤急性期神经血管单元保护的重要靶点Kir6.2敲除加剧脑缺血后神经血管单元各组分的损伤，与其加重内质网应激及炎症小体的激活相关，表明K-ATP通道是神经血管单元保护的重要靶点。2. Kir6.2/K-ATP通道参与缺血性脑损伤后期神经修复过程Kir6.2/K-ATP通道缺失有助于缺血性脑损伤后感觉运动功能的恢复，减轻脑缺血再灌注后期神经损伤，抑制胶质细胞活化，促进BrdU阳性细胞存活，减轻脑缺血损伤后记忆功能缺失，为靶向于K-ATP通道的药物在脑卒中神经损伤后期的临床治疗学应用积累了学术基础。3.内源性D-Ser调节神经干细胞的增殖与分化脑缺血再灌注损伤后SVZ区D-Ser含量显著升高，与此同时BrdU阳性细胞数量也显著增加，提示D-Ser可能参与了脑缺血后SVZ区神经再生；研究发现内源性胶质递质D-Ser能够调节神经干细胞的增殖与分化，为将D-Ser发展成为脑卒中后促进神经再生的治疗药物提供了理论依据。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-13
ABSTRACT  13-20
前言  20-32
第一部分 Kir6.2 /K-ATP 通道对 C57BL/6J 小鼠脑缺血再灌注损伤急性期的作用  32-49
  引言  32-33
  材料与方法  33-38
  结果  38-45
  讨论  45-48
  结论  48-49
第二部分 Kir6.2 /K-ATP 通道对 C57BL/6J 小鼠脑缺血再灌注损伤后神经再生的调节作用  49-64
  引言  49-50
  材料与方法  50-54
  结果  54-61
  讨论  61-64
  结论  64
第三部分离体研究：D-Serine 对 C57BL/6J 小鼠 SVZ 神经干细胞功能的调节  64-82
  引言  64-65
  材料与方法  65-70
  结果  70-76
  讨论  76-81
  结论  81-82
结语  82-84
参考文献  84-94
附录  94-107
  综述  94-107
    参考文献  100-107
在读期间发表的与本论文相关的文章  107-108
致谢  108

Kir6.2/K-ATP通道在C57BL/6J小鼠局部脑缺血再灌注损伤中的作用

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