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右丙亚胺对6-OHDA所致PD模型大鼠的神经保护作用

作　者: 柳梦笛
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 右丙亚胺 帕金森病 炎症小体 代谢性炎症 内质网应激 血脑屏障
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


帕金森病（Parkinson’s disease, PD）又称震颤麻痹，是全球第二大神经系统退行性疾病,在我国65岁以上老年人群中发病率约为2%。其临床特征主要包括静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和肌肉僵直，严重者伴有痴呆和记忆障碍，严重影响病人生活质量。PD的主要病理特征是黑质纹状体多巴胺（Dopamine,DA）神经元进行性丢失，脑内DA递质水平降低，残存黑质神经元周围出现嗜酸性包涵体路易小体（Lewy body）沉积，主要成分为纤维状α-Synuclein和泛素化蛋白，从而引起中枢神经系统及自主神经系统功能障碍。PD的病因至今仍未被完全阐明，老化、遗传因素、环境因素、氧化应激、铁沉积、感染、自由基生成增多、线粒体功能障碍、神经炎症及神经营养因子减少均与PD的发生发展相关，这些因素相互协同作用，最终导致多巴胺神经元变性坏死。由于氧化应激及铁沉积在PD发生发展中的重要作用，近年来铁离子螯合剂成为PD研究的新热点。然而，多数PD的神经保护剂应用于临床均效果不佳。目前PD最有效的治疗仍是应用左旋多巴（L-DOPA）替代性治疗，虽能显著改善大多数PD患者的运动症状，但是并不能从根本上阻止疾病的进展，亦不能逆转黑质DA能神经元退行性病变的进程。因此，研发理想的PD神经保护剂和治疗药物显得尤为紧迫和必要。右丙亚胺（Dexrazoxane, Dex）在1970年由Creighton合成，为双内酰亚胺类化合物，是一种强力金属螯合剂。Dex是EDTA的亲脂性衍生物，为DNA拓扑异构酶抑制剂，体内水解开环生成铁螯合剂ADR-925。Dex的临床主要与蒽环类抗肿瘤药如阿霉素联用，减轻后者诱导的心脏毒性，经FDA认证具有心肌保护作用，其主要机制为通过螯合铁离子，减少活性氧簇（Reactive oxygenspecies,ROS）生成，减轻氧化应激水平，从而起到心肌保护作用。1924年Lehermitt发现PD病人黑质（Substantia nigra，SN）中铁含量增加，PD动物模型如6-OHDA大鼠模型和MPTP小鼠模型中，也发现SN铁含量显著增加。由于铁浓度增高诱发氧化应激反应对细胞产生毒性作用，在PD发生发展过程中发挥重要作用。在生理状况下，Dex不能通过血脑屏障（Blood-brain barrie,BBB），然而在PD病理情况下BBB完整性受损，此时，Dex能否通过BBB、能否进入脑内发挥神经保护作用目前尚不清楚。本文应用6-羟基多巴（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备PD大鼠模型，评价Dex对PD模型鼠的实验治疗学作用，阐明Dex对6-OHDA模型大鼠的神经保护作用及其机制，为将Dex发展为PD治疗新药累积学术基础。目的：研究、阐明右丙亚胺对6-OHDA制备的PD模型大鼠神经损伤的神经保护作用及其机制。方法：1.制备6-OHDA诱导的PD大鼠模型：SD大鼠左侧纹状体立体定位注射6-OHDA8ug/uL，另取数只大鼠仅注射生理盐水溶剂，作为伪手术组。立体定位注射后大鼠饲养28天，颈部皮下给予阿扑吗啡（Apomorphine, APO，0.06mg/kg）诱导旋转行为，筛选造模成功的PD模型大鼠；2. PD模型大鼠实验分组：Dex治疗组（1.5、5、15mg/kg/day），L-DOPA治疗组（10mg/kg/day）大鼠每天均进行腹腔注射给药，持续21天；6-OHDA模型组、伪手术组大鼠均给予腹腔注射相应体积生理盐水，持续21天；3.应用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的IgG渗透法观察大鼠血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)的改变;4.应用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）检测大鼠血浆Dex药代动力学及PD模型大鼠脑内Dex浓度；5.在给药治疗的7、14及21天，各组大鼠均称量体重，进行APO诱导的旋转实验以及转棒行为学检测；6.应用免疫组织化学法观察大鼠黑质（Substantia nigra, SN）中酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase, TH）阳性细胞数以及胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillaryacidic protein, GFAP）阳性细胞数量的变化以及小胶质细胞标记CD-11b（OX-42）表达的变化；7.应用HPLC检测大鼠纹状体部分单胺类和中脑氨基酸类神经递质的变化；8.应用Perls’铁染色观察大鼠SN中铁沉积改变；9.应用黄嘌呤氧化酶法检测大鼠外周血浆及中脑超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活力的变化；应用硫代巴比妥酸（ThibabituricAcid, TAB）法观察大鼠外周血浆及中脑丙二醛（Maleic Dialdehyde, MDA）含量的变化；应用二硫代二硝基苯甲酸酶促法观察大鼠外周血浆及中脑谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-PX）活力的变化；10.应用免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠中脑内质网应激（Endoplasmic reticulum stress, ERS）水平的变化，核转录因子-κB（Nuclearfactor-κB, NF-κB）核转位改变，白介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）以及炎症小体（Inflammasomes）表达的改变；11.应用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测大鼠外周血肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-1β的变化,应用实时定量反转录聚合酶链式反应（Semi-quantitive reversetranscriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测大鼠中脑TNF-α水平的变化。结果：1．6-OHDA模型的制备与评价:大鼠颈部皮下注射APO（0.06mg/kg）后旋转圈数＞7rpm/min为模型成功大鼠，结果显示44只大鼠旋转圈数＞7rpm/min，模型成功率为88%；6-OHDA模型组纹状体手术侧TH神经元投射显著降低，中脑手术侧的TH阳性细胞绝对数较对照侧及生理盐水组手术侧显著减少；6-OHDA模型组大鼠纹状体手术侧DA含量较对照组及生理盐水组显著降低。2．6-OHDA模型BBB完整性评价：6-OHDA模型组和Dex治疗组（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）中脑均出现IgG沉积, Dex15mg/kg腹腔给药后，Dex通过6-OHDA模型大鼠BBB进入脑内，6-OHDA模型组大鼠脑内Dex浓度在给药后60min最高，且在三个脑区中纹状体>中脑>皮层，生理盐水组大鼠在腹腔注射Dex后脑内未能测到Dex；3．Dex改善6-OHDA模型大鼠的行为及运动协调能力：给予L-DOPA （10mg/kg/day）， Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天能显著改善6-OHDA模型大鼠APO诱导的旋转行为，L-DOPA （10mg/kg/day），Dex（5mg/kg/day,15mg/kg/day）组大鼠在给药21天后能显著延长6-OHDA模型大鼠的转棒棒上潜伏时间；4. Dex改善6-OHDA模型大鼠黑质致密部TH神经元丢失：Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天后能使纹状体手术侧TH神经元投射不同程度恢复，Dex5mg/kg/day及15mg/kg/day组大鼠给药21天后使黑质致密部手术侧TH神经元数目较模型组显著增加；5. Dex对6-OHDA模型大鼠神经递质的影响：Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天后不能改善6-OHDA诱导的纹状体DA降低，但对6-OHDA诱导的中脑Glu升高具有显著抑制作用；6. Dex抑制6-OHDA模型大鼠黑质致密部胶质细胞增殖活化：Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天后能显著降低6-OHDA诱导的模型组大鼠中脑GFAP阳性细胞数增高, Dex5mg/kg/day、15mg/kg/day组大鼠在腹腔注射21天后能显著降低6-OHDA诱导的模型组大鼠中脑OX-42阳性细胞数增高；7. Dex减轻6-OHDA模型大鼠中脑铁沉积：Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天后能显著降低6-OHDA诱导的模型组大鼠中脑铁染色阳性细胞数增高；8．Dex抑制6-OHDA模型大鼠外周血及中脑氧化应激水平：Dex（1.5mg/kg/day,5mg/kg/day,15mg/kg/day）腹腔注射21天后均能显著降低6-OHDA诱导的中脑及外周MDA增加，Dex（5mg/kg/day,15mg/kg/day）在给药21天后能显著升高中脑及外周SOD、GSH-Px活性；9．Dex减轻6-OHDA模型大鼠中脑内质网应激水平：Dex（5mg/kg/day,15mg/kg/day）在给药21天后能显著降低6-OHDA诱导的中脑Caspase-12、GRP-78表达增加，Dex（15mg/kg/day）在给药21天后显著降低6-OHDA诱导的中脑CHOP表达增加；10. Dex抑制6-OHDA模型大鼠外周及中枢代谢性炎症：Dex（5mg/kg/day,15mg/kg/day）在给药21天后使外周血IL-1β及TNF-α水平降低，减少中脑IL-1β表达和TNF-α mRNA水平，Dex（5mg/kg/day,15mg/kg/day）在给药21天后降低中脑Caspase-1和NLRP-3炎症小体表达。结论：1. Dex能在PD病理情况下透过模型大鼠的BBB；2. Dex能显著改善6-OHDA模型大鼠的行为学障碍和TH神经元丢失；3. Dex通过减轻中枢及外周氧化应激，减轻中脑炎症小体活化，减少中枢及外周炎症因子释放，从而发挥其神经保护作用。综上，本文工作的主要创新之处在于：1.PD病理条件下BBB通透性增加，Dex能够通过损伤的BBB进入脑内发挥神经保护作用，为将Dex发展为治疗PD的新药累积了重要的学术依据；2.阐明Dex在脑内通过抑制炎症小体和内质网应激发挥神经保护作用的新机制。

全文目录


英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-14
ABSTRACT  14-19
前言  19-28
材料和方法  28-35
结果  35-52
讨论  52-59
结论  59-60
结语  60-63
参考文献  63-71
综述  71-83
  参考文献  79-83
在读期间发表的研究论文  83-84
致谢  84

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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