学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

辅助生殖技术子代染色体11p15.5区印记控制区甲基化状态的研究

作　者: 倪运萍
导　师: 陈士岭
学　校: 南方医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 辅助生殖技术染色体核型印记基因 mRNA表达实时定量PCR 甲基化印记控制区甲基化差异性区域甲基化特异性PCR 甲基化联合酶切分析重亚硫酸盐测序 IGF2 H19 KCNQ1 KCNQ10T1
分类号: R714
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 36次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究背景体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)已有30余年的发展历程,到目前为止全世界范围内经辅助生育技术(assisted reproductive technology, ART)治疗出生的子代已超过三百五十万,且出生率呈逐年增加的趋势,ART子代正成为全球人口的一个重要组成部分。有报道提示在ART子代中健康风险增加,包括自然流产、低体重、极低体重、出生缺陷、脑瘫等,原因尚不明确。关于ART操作安全性的研究已成为当前遗传学界和生殖学界的一个热门研究领域。本研究即是关于ART操作安全性研究的一个分支。近年来印迹缺陷,包括Beckwith-Wiedemann综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)、Angelman综合征(Angelman Syndrome, AS)引起了人们的广泛关注。多项病例对照研究提示在ART子代中印迹缺陷风险增加。印迹基因等位基因特异性表达的破坏与人类遗传疾病、某些肿瘤及神经系统疾病相关,其亲缘特异性表达需要正常水平的DNA甲基化。印迹基因的甲基化在配子发生过程中擦除并重新建立,在种植前后维持甲基化,而ART技术在配子发生、受精及种植前后阶段操作配子和胚胎,这一时期恰恰是印迹基因甲基化重新编程的关键时期,因此可能导致印迹基因甲基化异常。另外,接受ART治疗的不育夫妇,很大比例在自然情况下并不具备孕育子代的能力,其生育能力的缺陷亦有可能会通过ART遗传给下一代,而是否与印记基因有关尚不得知。目前ART操作与印迹基因印迹状态的关系尚未明确。动物实验提示操作及体外培养胚胎可能破坏基因组印迹,而且在配子形成过程中发生的表观遗传改变在种植后的发育过程中不能纠正,可能与印迹基因表达异常及表型异常相关。但是人类研究尚未发现可检测的印迹基因表达异常。目前对于ART子代安全性的研究,以大样本的临床调查研究和对患有印记基因疾病病例进行实验室研究为主,而关于正常表型的ART子代印记基因的研究,只是近两年才开始见有散在的小样本报道,有必要扩大对ART子代关键印记控制区的印迹状态进行研究以排查ART操作的风险。人染色体11p15.5区是一个重要的印迹基因聚集的区域,该区基因失调可能与生长过度、肿瘤易感综合症、BWS、偏侧发育过度、SRS和新生儿短暂性糖尿病等有关。本文从遗传学和表观遗传学角度分析辅助生殖技术的安全性,对部分ART子代的脐血染色体核型进行分析,筛查正常表型ART子代是否可能存在染色体核型的异常,同时选取人染色体11p15.5上关键性的印记控制区1(H19印记控制区)与印记控制区2(KCNQ1印记控制区)进行研究,检测与生长发育密切相关的印记基因IGF2和H19mRNA的表达水平和两印记控制区的印记和甲基化状态,评估辅助生殖技术的安全性。第一部分辅助生殖技术子代IGF2和H19mRNA表达水平的研究目的印记基因IGF2和H19与调控生长发育及印记基因疾病的发生有密切的联系,我们通过研究ART子代脐血印迹基因IGF2与H19mRNA的表达水平以评估ART操作对子代生长发育情况和出生缺陷的影响。研究方法研究组为2008年至2009年于南方医院行ART治疗并在南方医院分娩的58例新生儿,包括异卵双胎40例,单胎18例,对照组为以同期自然妊娠分娩于南方医院的32例新生儿,包括30例单胎与2例异卵双胎,采集新生儿脐带血10-15ml (EDTA或肝素钠抗凝),记录新生儿出生体重、分娩孕周、母龄、受孕方式、有无出生缺陷及孕期监测情况等。采用荧光定量PCR技术(SYBR Green染料法)检测印记基因IGF2和H19mRNA的表达情况,数据处理采用2-⊿⊿Ct法,使用SPSS16.0软件进行统计学分析,样本均数比较使用T检验及单向方差分析(One-way ANOVA),方差不齐时使用近似F检验Welch法,两变量相关关系使用双变量相关分析(Bivariate), P<0.05为差异有统计学意义或有显著相关关系。结果1 ART组与自然妊娠组比较：ART组与自然妊娠组分娩孕周在34-40周之内,无一例新生儿有表型畸形,ART组中有19例异卵双胎为低出生体重儿(出生体重<2500g),其中16例为早产儿,对照组中有2例为低出生体重儿,其中1例为早产儿。ART组平均母龄高于自然妊娠组,而平均出生体重与分娩周数均低于自然妊娠组,差异均有统计学意义(p<0.05)。ART组IGF2基因与H19基因表达水平均高于自然妊娠组,差异有统计学意义(p<0.05)。ART组两印记基因表达水平的组内变异高于自然妊娠组。2 ART双胎组、ART单胎组与自然妊娠单胎组比较：ART双胎组与自然妊娠单胎组比较,母龄、分娩周数、出生体重、IGF2基因及H19基因表达水平之间均有有显著性差异(p<0.05); ART单胎组及ART双胎组母龄均高于自然妊娠单胎组(p<0.05)；而出生体重、分娩孕周均显示ART双胎组低于ART单胎组和自然妊娠单胎组(p<0.05)。H19基因与IGF2基因表达水平均为ART双胎组高于自然妊娠单胎组(p<0.05)。ART单胎组H19基因与IGF2基因表达水平的组内变异均大于自然妊娠单胎组。3 IVF组、ICSI组与自然妊娠组比较：58例ART子代包括采用常规体外授精(IVF)获妊娠分娩子代33例(单胎10例+双胎23例),单精了卵胞浆内注射(ICSI)子代22例(单胎7例+双胎15例),IVF+ICSI子代3例。IVF组母龄与H19基因表达水平高于ICSI组和自然妊娠组(p<0.05), ICSI组与自然妊娠组之间不存在显著性差异(p>0.05)；出生体重、分娩周数则显示IVF组和ICSI组均低于自然妊娠组(p<0.05), IGF2基因表达水平为IVF组和ICSI组均高于自然妊娠组(p<0.05)。IVF组两印记基因H19与IGF2表达水平的组内变异明显高于自然妊娠组,ICSI组IGF2基因表达水平的组内变异亦高于自然妊娠组。4.冻融胚胎移植组、新鲜胚胎移植组与自然妊娠组比较：58例ART子代中,包括新鲜移植胚胎获妊娠分娩子代44例(16例单胎+28例双胎)和冻融胚胎移植获妊娠分娩子代14例(2例单胎+12例双胎)。新鲜周期组母龄、IGF2基因表达水平高于自然妊娠组(p<0.05)；新鲜周期组和冻融胚胎组分娩周数、出生体重均低于自然妊娠组(p<0.05),H19基因表达在各组间均无显著性差异(p>0.05)。新鲜周期组和冻融胚胎组印记基因H19与IGF2表达水平的组内变异均高于自然妊娠组,冻融胚胎组两印记基因表达水平的组内变异亦有高于新鲜周期组的趋势。5.相关性分析：出生体重与分娩周数呈显著正相关关系,且相关关系密切(p<0.001,相关系数为0.710)；出生体重与H19基因表达水平有显著负相关关系,但相关关系并不密切(p<0.05,相关系数为-0.267)；分娩周数与IGF2基因表达水平有显著负相关关系,但相关关系并不密切(p<0.05,相关系数为-0.223)；印记基因IGF2与H19表达水平有显著正相关关系,但相关关系并不密切(p<0.001,相关系数为0.394)；母龄与出生体重、分娩周数、IGF2及H19表达水平均无显著相关关系(p>0.05)。结论1.印记基因H19及IGF2mRNA的表达对胎儿宫内生长发育起着一定的调节作用,但两基因的表达水平同时又受分娩孕周和出生体重影响。2.ART子代印迹基因IGF2与H19表达水平高于自然妊娠了代,与ART较高的双胎妊娠引发的早产低体重率有一定的关系。3.ART单胎组H19与IGF2基因表达水平的组内变异高于自然妊娠单胎组,提示ART操作可能会对印记基因的表达水平产生一定的影响。4. ICSI显微操作在常规IVF上基础上并未增加对印记基因IGF2与H19表达水平的影响。5.胚胎冻融操作在新鲜胚胎移植的基础上并未增加对印记基因IGF2与H19表达水平变化的影响。第二部分辅助生殖技术子代染色体11p15.5印记控制区印记与甲基化状态的研究目的人染色体11p15.5区域的印记基因的表达与甲基化状态主要由H19印记控制区和KCNQ1印记控制区两个印记控制区主导控制,该区域印记失调与印记疾病BWS、SRS等有着密切的联系,本研究即是对ART子代的这两个印记控制区的印记和甲基化状态进行探讨,比较ART子代与自然妊娠子代是否在这两个关键印记控制区存在差异性。研究方法收集2008年至2009年于南方医院行ART治疗并在南方医院分娩的61例新生儿作为研究组,包括异卵双胎43例,单胎18例,以同期自然妊娠分娩于南方医院的30例单胎为对照组,采集新生儿脐带血10-15ml(EDTA或肝素钠抗凝),其中3例ART双胎脐血收集量仅2ml,记录新生儿出生体重、分娩孕周、母龄、受孕方式、有无出生缺陷及孕期监测情况等。采用甲基化特异性PCR (MSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法对61例ART子代和30例自然妊娠单胎H19印记控制区(H19ICR)、KCNQ1印记控制区(KCNQ1 ICR)和IGF2甲基化差异性区域(DMR)的印记与甲基化状态进行检测,使用重亚硫酸盐测序法(BSP)验证20例H19 ICR的甲基化状态和15例KCNQ1 ICR的甲基化状态。两独立样本率的比较使用χ2检验。结果1.MSP检测到61例ART子代和30例自然妊娠子代的H19 ICR、KCNQ1 ICR及IGF2DMR的甲基化DNA链与非甲基化DNA链均存在。2.限制性内切酶TaqI与BstUI检测到3例ICSI双胎出现多个酶切位点的印记缺失,占总检测ART子代的比率为4.9%(3/61),与这3例双胎同胞妊娠的另3例ART子代经酶切检测均表现为H19 ICR的正常印记。病例资料显不ICSI操作缘于父方不育因素。3.BSP检测的20例样本中,3例ICSI双胎的H19 ICR甲基化程度<10%,处于低度甲基化状态,证实了TaqI与BstUI酶切检测到的相关位点的印记缺失；16例H19 ICR甲基化程度在34%-67%之间,1例为25%。4.限制性内切酶TaqI检测到16例样本出现H198271位点(基因库序列号AF125183)的C/T多态性(单核苷酸多态性,SNP), ART双胎发生率为自然妊娠单胎的2.5倍,ART子代发生率是自然妊娠子代的2.13倍,但并无统计学差异(p>0.05)。低体重儿较正常出生体重儿更易发生这种SNP,差异有统计学意义(p<0.05)。BSP证实了这种多态性的存在,并发现H198271位点的C/T多态性常和H197966位点的C/T多态性并存出现。5. TaqI与BstUI未检测到KCNQ1 ICR有相关酶切位点的印记缺失。6.BSP法检测15例样本的KCNQ1 ICR,其中有6例样本的甲基化程度>70%,包括两例自然妊娠低体重儿、1例ICSI单胎足月正常体重儿、1例ICSI早产低体重双胎和2例IVF早产低体重双胎。7. H19 ICR与KCNQ1 ICR甲基化程度无显著相关关系(p>0.05),但相关系数为负值。8. BstUI检测61例ART子代和30例自然妊娠子代的IGF2 DMR均处在正常的甲基化状态。结论1.正常表型的ART子代不伴有H19ICR、KCNQ1 ICR与IGF2 DMR印记的完全缺失。2.3例ICSI双胎表现出H19 ICR多个位点的印记缺失和低度甲基化状态,可能与使用父方提供的异常的精子授精有关。3.H198271位点完全非甲基化(C/T多态性)的现象易发生于低体重儿,该位点可能与生长发育有一定的关系。4. KCNQ1 ICR对生长发育起着一定的调控作用,当其表现为高度甲基化时对生长发育有一定的抑制作用。5.ART子代出现异常的印记与DNA甲基化时并不一定伴有表型的异常。第三部分辅助生殖技术子代染色体核型分析目的染色体核型分析是最常规用于筛查遗传缺陷的检测方法,本研究对ART子代行染色体核型分析以排查ART操作是否会对子代造成直接的遗传风险。研究方法研究组为48例使用ART治疗妊娠的子代,包括行常规IVF获妊娠出生者30例,行ICSI获妊娠出生者18例,对照组为20例同期于我院出生母龄匹配的自然妊娠子代,采集脐带血,使用肝素钠抗凝。使用常规淋巴细胞培养方法行染色体核型分析。结果除两例中期妊娠引产的ART无脑儿外,其余ART子代和所有的自然妊娠子代均无出生缺陷的发生,染色体核型分析显示48例ART子代与20例自然妊娠子代均为正常核型。结论伴有染色体核型异常的病例多在早期胚胎发育阶段就遭到了淘汰,本研究未发现ART子代有染色体核型异常的病例,可能与样本量较小有关。

全文目录

中文摘要  3-11
ABSTRACT  11-18
前言  18-32
第一部分辅助生殖技术子代IGF-2和H19 mRNA表达水平的研究  32-53
  一、材料和方法  32-39
  二、结果  39-49
  三、讨论  49-53
第二部分辅助生殖技术子代染色体11p15.5印记控制区印记与甲基化状态的研究  53-95
  一、材料和方法  53-68
  二、结果  68-86
  三、讨论  86-95
第三部分辅助生殖技术子代染色体核型分析  95-99
  一、材料与方法  95-96
  二、结果  96-97
  三、讨论  97-99
全文总结  99-100
参考文献  100-111
缩略词表  111-113
致谢  113-115
统计学证明  115-116

辅助生殖技术子代染色体11p15.5区印记控制区甲基化状态的研究

内容摘要

全文目录

相似论文