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冷冻对精子凋亡及印记基因DNA甲基化修饰的长时程效应研究

作　者: 梁新新
导　师: 王晓红; 李博
学　校: 第四军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 表观遗传印记基因甲基化 H19 KvDMR1
分类号: R714
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

精子冷冻保存是男性生殖能力延续的主要技术方法之一，在人类辅助生殖领域和精子库样品保存中应用广泛。据报道，人类精子在冷冻保存28年后成功复苏，并借助辅助生殖技术成功受孕，但我们对担负着繁衍后代重任的精子的要求，绝不仅仅是可以生育这么简单。近年来，越来越多的癌症患者在进行放、化疗前有生殖力保存的愿望，而且在辅助生殖领域，一些少精症或者高位截瘫男性患者，为了实现繁衍后代的目的，必须通过附睾穿刺的方式获得精子（不含精浆）并低温冷冻保存，进一步等待合适的时机借助“试管婴儿”技术孕育后代。伴随着人类精液冷冻技术的广泛使用，其安全性也受到了越来越多的关注。低温冷冻虽然可以延长精子保存时间，但在冷冻过程中冰晶的形成、氧化应激反应以及高溶质引起的溶液效应均有可能造成精子细胞膜、DNA完整性、线粒体功能等方面的损伤，进一步影响到受精能力甚至胚胎质量。表观遗传是一门真正将环境应力与基因遗传联系在一起的学科，指在DNA序列不发生变化的情况下，基因表达却发生了变化，而且这种变化能够在发育和细胞增殖过程中稳定传递。其中DNA甲基化作为表观遗传的重要组成部分，因其发现较早和相对稳定的遗传基础而备受关注。有研究显示，胚胎印记基因的DNA甲基化易受到外界环境因素（温度、渗透压、体外操作等）的影响，而且这种DNA甲基化异常与男性不育以及胎儿印记基因缺陷疾病密切相关，如父源印记基因H19印记控制区域的DNA甲基化修饰异常会引起绒毛滋养层细胞侵润能力下降以及SRS和BWS疾病的高发，母源印记基因KvDMR1也与AS/BWS高发密切相关。目前，国内外鲜有关于人类精子冷冻后的印记基因DNA甲基化修饰的损伤评估。因此，本研究从精子DNA完整性、DNA甲基化修饰两个方面，综合评估精子冷冻的安全性。目的：检测冷冻及冷冻时间长短对精子凋亡以及精子印记基因（父源H19、母源KvDMR1）的印记控制区域（ICR）的DNA甲基化修饰的影响。方法：以15例健康男性精液为研究对象，将每份精液样品除留少许作为对照外，其余分为两部分（每部分又等分为若干份），一部分连同精浆一起进行程序化冷冻，另一部分通过Isolate法去除精浆后冷冻，并分别于冷冻后1个月、3个月、6个月和12个月时，通过亚硫酸氢盐测序PCR的方法分析H19，KvDMR1ICR的DNA甲基化状态。进一步通过流式细胞术检测去除精浆冷冻1个月、3个月、6个月后精子的凋亡情况。结果:1.连同精浆一起冷冻的精子样品，冷冻1个月、3个月和6个月后，父源印记基因H19ICR的DNA甲基化丢失率分别为13.62±2.06%、14.88±1.96%、15.89±2.26%，与对照相比（12.74±2.85%）无显著差异（P>0.05）；母源印记基因KvDMR1ICR的DNA甲基化与对照相比无增加，即无显著差异（P>0.05）。2.去除精浆后冷冻的精子样品，与对照相比（H19，12.74±2.85%），冷冻1个月、3个月、6个月后，父源印记基因H19ICR的DNA甲基化丢失率分别为15.24±1.91%（P>0.05）、13.49±2.63%（P>0.05）和30.92±3.08%（P<0.01），母源印记基因KvDMR1ICR的DNA甲基化改变在冷冻12个月内与对照相比无显著差异（P>0.05）。3.进一步对去除精浆冷冻1个月、3个月、6个月的精子样品检测其凋亡情况，结果显示，与对照组相比无显著差异（P>0.05）。结论：在精子冷冻保存过程中，与DNA损伤相比，精子印记基因的DNA甲基化修饰，尤其是父源印记基因，更容易受到影响，而且这种影响表现出一种时间依赖的长时程效应。

冷冻对精子凋亡及印记基因DNA甲基化修饰的长时程效应研究

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