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与sFlt-1相关的miR-10b和miR-200c在子痫前期发病中作用的研究

作　者: 李怡
导　师: 姚元庆
学　校: 第四军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子痫前期 胎盘 sFlt-1 miR-10b miR-200c
分类号: R714.244
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


子痫前期(pre-eclampsia，PE)是一种严重的妊娠特有疾病，发病率约为10%，是妊娠期导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。较早的研究发现PE患者外周血可溶性血管内皮生长因子1(soluble fms-like tyrsine kinase-1，sFlt-1)表达异常增高，在子痫前期的发生和发展发挥着重要的作用。目前关于sFlt-1导致子痫前期发病的机理，普遍认为在PE患者发病起始，由于某种原因导致患者胎盘sFlt-1表达异常增高，致使患者胎盘血管重铸障碍及全身毛细血管内皮损伤。但是，导致sFlt-1表达异常增高的具体机制尚不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类非编码小分子RNA，多项研究已经证明其在基因调控方面起着重要的作用。近来的研究表明，某些miRNA在小鼠和人胎盘组织中表达异常升高，在PE患者胎盘中差异表达。越来越多的研究证实在PE患者胎盘中部分差异表达的miRNA在细胞粘附、免疫、信号传导与细胞周期、心血管的发育等等，这些在子痫前期发病中起着主要作用的通路上发挥着重要的作用。由此可见，miRNA与子痫前期的关系是一个全新的研究热点。在前期的实验中，我们发现PE患者胎盘中miR-10b及miR-200c存在差异表达，生物信息学软件预测其异常表达可能与sFlt-1异常增高相关。因此有必要从miRNAs角度深入研究导致sFlt-1异常表达的具体机理，及其对sFlt-1生物学功能的影响，从而为研究子痫前期发病机理提供新的线索。目的1.检验miR-10b和miR-200c是否在PE胎盘组织中与正常胎盘存在差异表达，验证其与sFlt-1是否具有相关性。2.阐明miR-10b和miR-200c与sFlt-1的靶向调节关系。3.研究miR-10b对正常人滋养细胞系（HTR-8/SVneo））生物学功能的调控，进一步揭示其发病机理。方法1. ELISA检测不同孕周孕妇外周血血清sFlt-1的表达以及孕晚期PE患者与正常孕妇外周血sFlt-1的差异表达；step-loop实时定量PCR(Real-time PCR)的方法验证PE组与正常孕妇组中miR-10b及miR-200c的表达；验证miR-10b及miR-200c表达与sFlt-1差异及患者病情轻重是否存在相关性。2.构建sFlt-1表达质粒，荧光素酶报告基因技术验证miR-10b及miR-200c与sFlt-1的靶向作用关系；过表达miR-10b后， Real time PCR技术检测在人正常滋养细胞系(HTR-8/SVneo)中miR-10b及sFlt-1mRNA的表达；同时ELISA检测sFlt-1的蛋白表达。3.在人正常滋养细胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b，采用MTT、流式双染细胞术、侵袭小室技术、三维细胞成型实验，检测抑制miR-10b对于滋养细胞凋亡、增殖周期、浸润以及血管内皮成型功能等功能的影响。结果1. ELISA结果显示，在不同孕周孕妇外周血血清中sFlt-逐渐升高，s-PE患者外周血中sFlt-1明显高于正常妊娠组（5795.7±629.11VS2144.2±406.16）（P＜0.05）。step-loop实时定量PCR(Real-time PCR)结果显示，PE患者胎盘组织中miR-10b的表达较正常孕妇组明显降低（0.43±0.21VS1.08±0.32）（P＜0.05），而PE患者中miR-200c的表达较正常孕妇组升高（5.26±0.35VS1.07±0.03）（P＜0.05）。miR-10b及200c差异表达与sFlt-1具有一定的相关性。2.采用荧光素酶报告基因系统进行靶点验证，构建含有sFlt-1全长3’UTR的GV126-sFlt-1-3’UTR报告基因质粒，分别含有针对结合种子区突变4个碱基的突变体GV126-sFlt-1-3’UTR-mut1(10b)和GV126-sFlt-1-3’UTR-mut2(200c)。结果证实，转染miR-10b mimcs与野生型载体的实验组后荧光素酶活性下降40%，而突变体无明显改变；转染miR-200c mimcs与野生型载体的实验组起荧光素酶活性无明显改变。此外，在人正常滋养细胞系(HTR-8/SVneo)中抑制miR-10b，ELISA结果显示，细胞培养液中sFlt-1增加42%。3. MTT及流式双染细胞术结果显示，在人正常滋养细胞系(HTR-8/SVneo)抑制miR-10b表达，各实验组与对照组在细胞周期、细胞增殖及凋亡无明显差异(P＞0.05)；但是侵袭实验显示；miR-10b对滋养细胞的浸润有明显的促进作用，两者间存在明显差异（41.25±7.8VS65.8±11.6）(P <0.05)。抑制表达miR-10b后滋养细胞的培养液sFlt-1实验组与对照组有明显差异（310.5±20.4VS182.3±38.5）（p＜0.05），对人血管内皮细胞成型功能有抑制作用（2.43±0.28VS6.32±0.32）（p＜0.05）。结论1.子痫前期患者胎盘组织miR-10b及200c存在异常表达，这种异常表达与sFlt-1的异常表达存在相关性，导致了子痫前期的发病。2. miR-10b通过调控sFlt-1的表达参与了子痫前期的发生。3. miR-10b通过促进滋养细胞的浸润能力并且刺激滋养细胞产生过多的sFlt-1影响血管内皮成型，影响胎盘早期发育，参与子痫前期发病。

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠） > 妊娠中毒症 > 先兆子痫
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