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低剂量放疗诱导宫颈癌上皮—间质转化分子机制的研究

作　者: 闫实
导　师: 孔北华
学　校: 山东大学
专　业: 妇产科学
关键词: 宫颈癌 低剂量分级放疗 放疗耐受 上皮-间质转化 microRNA
分类号: R737.33
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景与目的：恶性肿瘤严重危害着人类的健康,其中宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,其发病率在女性生殖系统肿瘤发病率位居第二,死亡率位居第五。全世界每年约有50万新发病例,其中约30万的患者死于宫颈癌,在我国宫颈癌发病率居世界第二位,严重危害女性健康。目前,治疗宫颈癌的方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗,根据2010NCCN宫颈癌临床实践指南,放疗是治疗宫颈癌的重要手段之一,其适应症广泛,除严重的肝肾功能,造血功能障碍外,Ⅰ～Ⅳ期患者均可进行放射治疗,尤其对于晚期、复发或者无法手术的患者,放射治疗是治疗的重要方法。然而由于个体体质的差异以及肿瘤的异质性,不同患者对放射治疗的反应不同,存在着放疗敏感性和放疗耐受性的差异,放疗后达到治疗效果也不一样,放疗耐受是宫颈癌治疗失败而出现复发转移的重要原因之一。因此,阐明宫颈癌放疗耐受性的机制将有望为设计宫颈癌的个体化治疗提供理论基础,也将为开发逆转宫颈癌放疗耐受的治疗手段提供新的思路。在肿瘤微环境中,许多因素影响肿瘤细胞对放射治疗的反应。离子放射激活与细胞凋亡,DNA损伤修复,细胞粘附和血管新生信号通路相关的一系列基因,反过来,这些基因又调节细胞内的放疗反应,影响放疗效果。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞丢失细胞间的连接,获得间质特性的过程。包括细胞上皮特异性连接蛋白E-cadherin的重新分布或丢失,间质marker N-cadherin和vimentin的发动,细胞的形态改变为狭长的纺锤状,迁移能力增强。EMT是上皮细胞在特定的生理和病理情况下转化为具有间质表型细胞的生物学过程,该过程也发生在肿瘤进展过程中。近年来上皮间质转化在肿瘤中的作用逐渐被重视,研究报道EMT在肿瘤的发生发展、浸润转移等方面发挥着重要的作用。最近研究报道一些microRNA可以调控这一重要的生物学过程。MicroRNA(miRNA)是内源基因编码的、长度约20-24个核许酸的非编码单链小RNA分子。microRNA通过调节关键的靶基因mRNA,影响分化、增殖、代谢和凋亡多种细胞过程。miRNA在肿瘤里的图谱和在正常组织的表达图谱不同,这类图谱可以作为疾病分类的新的方法。miRNA对EMT有很重要的调节作用,miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及疾病的发生中扮演重要的角色。miRNA-200c直接作用于转录抑制因子ZEBl及ZEB2的mRNA,上调肿瘤细胞系中E-cadherin的表达,从而减少EMT的发生。miR-200家族的成员(miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141, miR-429)和miR-205表达在发生EMT的MDCK细胞中显著下调。microRNA的下调是EMT过程中的一个必要成分,已经证实TGFβ敏感的miR-200和ZEB之间通过双向负反馈环(double-negative feedback loop)影响EMT。EMT在肺癌中影响miRNA的表达,并且通过EMT调节肺癌细胞的侵袭和转移。因而阐明调控肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制,明确其在恶性肿瘤的发生、进展的作用,并探索基于EMT的诊断方法具有重要的临床意义。NF-κB是在调节细胞凋亡和肿瘤发生中起重要作用的转录因子,而且是在诱导EMT和维持EMT中是必不可少的。NF-κB信号的强度和持续时间由多个负反馈机制控制,从而使NF-κB信号在癌细胞中保持其致癌性。microRNA对NF-κB有调节作用来调控NF-κB调节的基因表达,影响这些基因的功能。在神经胶质瘤miR-182过表达,直接抑制CYLD(肿瘤抑制基因)(NF-κB的负性调节子)的表达,促进泛素结合NF-κB信号通路成分诱导胶质细胞农现侵袭性表型。并且TGF-β诱导的miR-182表达可以延长NF-KB的活化时间。miR-146a在大部分胃癌表达上调,抑制GPCR(G蛋白偶联受体)介导的NF-κB的激活,因而减少NF-κB调节的肿瘤促进激酶表达和生长因子的表达。通过作用于NF-κB活化通路的一些成分,miR-146a在调节NF-κB活性中起关键作用。miRNA与p53, NF-κ B, β-catenin通路相互作用在调节EMT和保持肿瘤干细胞中起重要作用。乳腺癌中抑制miR-448通过直接作用于特异的AT-富集序列结合蛋白-1(SATB1)的mRNA,导致双调蛋白水平升高,表皮生长因子(EGFR)受体介导的Twistl表达升高,NF-κ B激活,从而可以诱导EMT。基于这些报道,我们猜想miRNA调节NF-κ B在宫颈癌放疗耐受相关EMT中起作用。本研究旨在阐明宫颈癌放疗耐受的机制,为设计宫颈癌的个体化治疗提供理论基础。本课题进行了三部分的研究：(1)建立宫颈癌放疗耐受细胞株；(2)宫颈癌放疗耐受细胞株EMT的发生及机制研究；(3)宫颈癌放疗耐受相关miRNA的筛选及功能分析。方法：根据文献报道及2010NCCN宫颈癌临床实践指南自行建立放疗耐受(FIR)的细胞模型进行实验研究。采用低剂量持续分级放疗的方法,给予2Gy/day的剂量照射宫颈癌细胞株SiHa, C-33A,5days/week,至总剂量达到75Gy,细胞休息2周后实验。进行克隆形成实验、细胞周期及凋亡的检测验证FIR细胞是否对放疗耐受。在建立FIR细胞进行放疗的过程中,进行形态学观察,发现与亲本细胞相比,FIR细胞株发生了显著的形态学改变,此改变符合EMT。为了证实FIR细胞株是否真正发生了EMT,我们进行western blot实验检测了EMT的标志蛋白E-cadherin和N-cadherin的变化。确定FIR细胞株发生EMT后,进行定量PCR实验在mRNA水平,western blot实验在蛋白水平检测FIR细胞与亲本细胞(N细胞)其他EMT marker的变化,并进行分子机制研究。使用siRNA干扰FIR细胞中NF-κ B p65表达后,检测EMT marker表达,研究NF-κ B p65是否参与调控低剂量放疗诱导的宫颈癌EMT。miRNA表达谱芯片是研究miRNA的有力工具,通过对宫颈癌放疗耐受细胞株与亲本细胞的miRNA表达谱的分析,筛选出放疗耐受相关的miRNA,为今后开发逆转宫颈癌患者放疗耐受的新治疗手段提供新的靶标。我们使用microRNA芯片检测宫颈癌N细胞及FIR细胞,筛选与放疗耐受相关的microRNA。合成miRNA的引物,定量PCR验证芯片数据结果,并对显著差异的miRNA进行功能研究,筛选放疗耐受相关miRNA。合成FIR细胞表达降低的miRNA的模拟物mimic miRNA,导入FIR细胞后,定量PCR和western blot检测EMT marker表达变化。同时western blot检测宫颈癌FIR细胞表达NF-κB p65的变化；siRNA干扰FIR细胞表达的NF-κB p65后定量PCR实验检测miRNA表达的变化。结果：克隆形成实验显示亲木细胞和FIR细胞接受2Gy的X-ray照射后,FIR细胞克隆形成的能力比亲本细胞增强；FIR细胞倍增的时间比亲本细胞长；接受不同剂量的X-ray照射后,FIR细胞凋亡率低于亲本细胞,说明FIR细胞耐受放疗。这些结果表明宫颈癌FIR细胞具有宫颈癌放疗耐受的特点,宫颈癌放疗耐受细胞系建立成功。在建立宫颈癌FIR细胞,对宫颈癌N细胞进行放疗的过程中,通过形态学观察,发现与亲本细胞相比,FIR细胞株发生了显著的形态学改变,细胞由铺路石样的上皮表型变成细长的间质表型,此改变符合上皮-间质转化,同时细胞迁移和侵袭的能力增强。为了证实FIR细胞株是否真正发生了EMT,我们进行western blot检测了EMT的标志蛋白E-cadherin和N-cadherin的变化,结果显示FIR细胞表达的E-cadherin降低,N-cadherin表达升高,从而初步证实了FIR细胞有EMT的改变。进一步进行定量PCR实验在mRNA水平,western blot实验在蛋白水平检测FIR细胞与亲本细胞其他EMT marker的变化,发现上皮性marker CK-18表达降低,间质marker vimentin表达升高。使用siRNA干扰FIR细胞中,p65农达后,E-cadherin表达升高,N-cadherin农达降低,说明NF-κB p65参与调控低剂量分级放疗诱导的宫颈癌放疗耐受相关EMT。mieroRNA芯片检测宫颈癌亲本细胞及FIR细胞,筛选与放疗耐受相关的miRNA。结果显示,在1198个mieroRNA探针中有20个mieroRNA有差异,定量PCR验证了世片数据结果。合成FIR细胞表达降低的miRNA的模拟物mimic miRNA,导入FIR细胞后,定量PCR和western blot检测EMT marker表达变化,其中导入mimic miR-1236后FIR细胞表达的E-cadherin升高和N-cadherin表达降低,差异有显著性,说明miR-1236参与调节低剂量分级放疗引起的宫颈癌放疗耐受相关EMT。进一步研究发现FIR细胞导入miR-1236后NF-κ B p65的表达降低,同时使用siRNA干扰NF-κ B P65后FIR细胞表达的miR-1236比对照组显著升高,说明miR-1236和NF-κ B p65相互调节在低剂量分级放疗诱导的宫颈癌EMT导致的放疗耐受中起调控作用。结论：1.低剂量分级持续放疗可以诱导宫颈癌细胞发生上皮-间质转化而发生放疗耐受。2. NF-κ B p65参与调控宫颈癌放疗耐受相关的EMT。3. miR-1236参与调控宫颈癌放疗耐受相关的EMT。4. miR-1236和NF-κ B p65相互调节在低剂量分级放疗诱导的宫颈癌EMT导致的放疗耐受中起调控作用。意义：1.阐明宫颈癌放疗耐受的机制将有望为设计宫颈癌的个体化治疗提供理论基础。2. NF-kB p65及筛选出来的的microRNA也将为开发逆转宫颈癌放疗耐受的治疗手段提供新的靶标。3.本研究建立的宫颈癌放疗耐受细胞株可以用于放疗耐受相关的其他分子生物学研究。

全文目录


中文摘要  8-13
ABSTRACT  13-18
符号说明  18-21
前言  21-25
第一部分 宫颈癌放疗耐受细胞株的建立  25-42
  材料与方法  25-33
  结果  33-34
  讨论  34-36
  结论  36-37
  附图  37-39
  参考文献  39-42
第二部分 宫颈癌放疗耐受细胞株EMT的发生及机制研究  42-69
  材料与方法  42-58
  结果  58-60
  讨论  60-62
  结论  62-63
  附图  63-67
  参考文献  67-69
第三部分 宫颈癌放疗耐受相关miRNA的筛选及功能分析  69-92
  材料与方法  69-80
  结果  80-82
  讨论  82-85
  结论  85-86
  附图  86-89
  参考文献  89-92
全文总结  92-93
致谢  93-94
攻读学位期间发表的学术论文目录  94-95
学位论文评阅及答辩情况表  95-96
外文论文  96-125

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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