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RNAi沉默COX-2表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响及miR-92在EOC患者血清中表达的研究

作　者: 郭凤军
导　师: 崔满华
学　校: 吉林大学
专　业: 妇产科学
关键词: 卵巢癌 环氧合酶-2 RNAi 增殖 侵袭 基因治疗 miR-92 肿瘤标志物 血清 上皮性卵巢癌 筛查
分类号: R737.31
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：应用质粒介导的RNA沉默技术，通过体内外实验观察COX-2基因沉默对人卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响。探讨COX-2基因在卵巢癌发生发展中的作用，为COX-2靶向卵巢癌治疗提供理论依据。方法：1.针对COX-2基因的靶点序列设计、合成COX-2shRNA序列，通过退火及酶切等技术将COX-2shRNA双链模板插入到质粒pGPU6/GFP/Neo中，构建重组质粒pGPU6-COX-2-shRNA。经过转化入大肠杆菌感受态细胞、筛选阳性重组菌落、扩增等操作后，将提取的重组质粒进行酶切及DNA测序鉴定。将测序鉴定结果正确的重组质粒分别瞬时转染和稳定转染入SKOV3细胞，通过RT-PCR及Western-blot等方法，检测稳定转染COX-2shRNA后，COX-2mRNA及蛋白的表达水平。2.通过体外实验观察COX-2基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的影响：MTT法检测细胞的增殖能力；平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力；流式细胞术检测细胞的细胞周期变化；Transwell法检测细胞的侵袭能力。3.利用稳定转染的pGPU6-COX-2-shRNA的SKOV3细胞建立裸鼠皮下卵巢癌种植瘤模型，对细胞的出瘤时间、瘤体体积、瘤体重量进行检测，分析COX-2沉默对裸鼠皮下种植瘤生长的影响。结果:1.成功构建重组质粒pGPU6-COX-2-shRNA。2.将重组质粒pGPU6-COX-2-shRNA瞬时及稳定转染入SKOV3细胞，筛选稳定转染pGPU6-COX-2-shRNA的SKOV3细胞系。3.重组质粒pGPU6-COX-2-shRNA可有效抑制COX-2的mRNA及蛋白的表达。4.沉默COX-2基因表达可显著抑制SKOV3细胞的增殖及侵袭能力，并将细胞周期阻滞于G1期。5.与对照组比较，干扰组的成瘤时间明显延长，肿瘤体积及瘤体重量明显减少。结论:体内外实验表明，抑制卵巢癌SKOV3细胞COX-2表达可以有效抑制肿瘤的增殖、生长及侵袭，并影响细胞周期，以此基因为靶点进行的RNAi基因治疗，将有可能为人类卵巢癌提供新的策略。目的：卵巢癌，尤其是占其90%的上皮性卵巢癌（epithelial ovariancancer EOC），是女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤。由于，缺乏明显的临床症状，2/3的卵巢癌患者发现时己伴有远处转移。因此，寻找卵巢癌早期诊断的标志物，对于卵巢癌患者的早期诊断及提高患者的生存率至关重要。尽管CA125及CA199的检测提高了上皮性卵巢癌的诊出率，但缺乏特异性。因此，发展一种新的花费少、敏感性好、特异性高的无创性筛查标志物，对于上皮性卵巢癌的诊断至关重要。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是近年来新发现的一类的非编码蛋白质的小分子RNA，大约由18～24个核苷酸组成。广泛参与细胞增殖、分化、细胞周期及细胞凋亡等生理及病理过程。研究表明，miRNAs在正常组织及肿瘤组织中的表达谱存在差异。许多研究报道血液中的miRNAs可以作为癌症诊断的生物标志物。但是关于上皮性卵巢癌患者血液中的miRNA的报道却很少。本研究旨在检测上皮性卵巢癌患者血清中microRNA-92（miR-92）的表达情况，探讨血清中miR-92的表达与上皮性卵巢癌患者临床病理特征之间的关系。为寻找一种新的、无创性的用于上皮性卵巢癌患者筛查和判定预后的标志物提供理论依据。方法：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测50例上皮性卵巢癌患者以及50例健康人群血清中miR-92表达。并对血清中miR-92的表达与临床病理特征之间的相关性进行分析。结果：miR-92作为上皮性卵巢癌筛查的标志物，具有良好的敏感性和特异性；miR-92在卵巢癌患者血清中的相对表达量显著高于及正常对照组(P<0.05)。miR-92表达随卵巢癌的临床分期和组织分级的进展呈上升趋势，而且在有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。miR-92的表达与年龄等因素无关。结论：miR-92在上皮性卵巢癌患者血清中表达升高，提示其可能在上皮性卵巢癌的发生发展中发挥致癌基因的作用，有望成为上皮性卵巢癌的早期筛查及预后评估的特异性标志物。

全文目录


第一部分中文摘要  4-6
第一部分英文摘要  6-8
第二部分中文摘要  8-10
第二部分英文摘要  10-18
第一部分 英文缩写词表  18-20
第二部分 英文缩写词表  20-21
第一部分  21-79
  第1章 综述  21-31
    1 人类 COX-2 基因及蛋白的结构  21-22
    2 COX-2 的表达及调控机制  22-23
    3 COX-2 在卵巢肿瘤中的表达  23-25
      3.1 COX-2 在良恶性卵巢肿瘤中表达  23
      3.2 COX-2 表达与卵巢癌的病理类型间的关系  23
      3.3 COX-2 的表达与卵巢癌临床分期间的关系  23-24
      3.4 COX-2 的表达与卵巢癌病理分级间的关系  24
      3.5 COX-2 的表达与卵巢癌淋巴结转移间的关系  24
      3.6 COX-2 的表达与卵巢癌患者是否伴有腹水间的关系  24
      3.7 COX-2 的表达与卵巢癌患者对化疗敏感性及预后的关系  24-25
      3.8 COX-2 多态性与卵巢癌患病风险的关系  25
    4 COX-2 促进卵巢癌发生发展的主要机制  25-27
      4.1 促进细胞增殖，抑制细胞凋亡  25-26
      4.2 调节细胞周期  26
      4.3 促进肿瘤中新生血管的形成  26
      4.4 增加肿瘤细胞的侵袭力  26-27
      4.5 抑制肿瘤患者的免疫力  27
    5 COX-2 抑制剂对卵巢癌的防治作用  27-31
  第2章 pGPU6-COX-2-shRNA 质粒表达载体的构建、鉴定及稳定转染细胞的筛选  31-57
    前言  31-32
    材料和方法  32-50
      1 主要试剂、实验仪器、质粒及细胞株  32-35
      2 pGPU6-COX-2-shRNA 质粒的构建、抽取及鉴定  35-50
      3 统计学处理  50
    结果  50-53
      1. pGPU6-COX-2-shRNA重组质粒的DNA测序结果  50
      2. 重组质粒转染 SKOV3 细胞  50-53
    讨论  53-56
    小结  56-57
  第3章 RNAI 沉默 COX-2 基因表达对 SKOV3 细胞生物学行为影响的体外研究  57-69
    前言  57
    材料和方法  57-60
      1 细胞、主要试剂及主要实验仪器设备  57-58
      2 RNAi 沉默 COX-2 基因表达对 SKOV3 细胞生物学行为影响的体外实验  58-60
      3 统计学分析  60
    结果  60-64
      1 COX-2 基因沉默对 SKOV3 细胞增殖能力的影响  60-61
      2 COX-2 基因沉默对 SKOV3 细胞克隆形成能力的影响  61-62
      3 COX-2 基因沉默对 SKOV3 细胞周期的影响  62-63
      4 COX-2 基因沉默对 SKOV3 细胞侵袭能力的影响  63-64
    讨论  64-67
    小结  67-69
  第4章 RNAI 沉默 COX-2 基因表达对人卵巢癌裸鼠皮下种植瘤生长的影响  69-77
    前言  69-70
    材料与方法  70-72
      1 主要实验试剂、仪器、实验细胞及实验动物  70-71
      2 人卵巢癌裸鼠皮下种植瘤模型的建立  71
      3 统计学分析  71-72
    结果  72-73
      1 裸鼠皮下种植瘤成功率及荷瘤裸鼠的生存状态  72
      2 裸鼠皮下种植瘤体积的测量和比较  72-73
      3 裸鼠皮下种植瘤重量的测量和比较  73
    讨论  73-75
    小结  75-77
  第5章 结论  77-78
  课题创新性总结  78-79
第二部分  79-109
  第1章 综述  79-95
    1 MIRNAS 的研究现状  79-82
      1.1 miRNAs 的生成  79-80
      1.2 miRNAs 的检测方法  80-81
      1.3 miRNAs 作用的靶基因  81-82
    2 miRNAs 与肿瘤  82-84
      2.1 miRNAs 在肿瘤的发生发展中的作用  82-83
      2.2 miRNAs 在肿瘤发生和发展中的作用机制  83-84
    3 miRNAs 与卵巢癌  84-90
      3.1 miRNAs 在卵巢癌中的表达  84-86
      3.2 miRNAs 与卵巢癌的复发与转移  86-87
      3.3 miRNAs 与卵巢癌的耐药性  87-89
      3.4 miRNAs 在卵巢癌中作用的靶基因  89-90
    4 miR-92 与恶性肿瘤的关系  90-94
      4.1 miR-92 表达模式  90-91
      4.2 miR-92 的靶基因  91
      4.3 miR-92 与肿瘤的关系  91-94
        4.3.1 miR-92 与肝癌  91-92
        4.3.2 miR-92 与结直肠癌  92
        4.3.3 miR-92 与多发性骨髓瘤  92
        4.3.4 miR-92 与膀胱癌  92-93
        4.3.5 miR-92 与乳腺癌  93
        4.3.6 miR-92 与卵巢癌  93
        4.3.7 miR-92 与白血病  93
        4.3.8 miR-92 与神经母细胞瘤  93-94
    5 展望与前景  94-95
  第2章 miR-92 在上皮性卵巢癌患者血清中的表达  95-107
    前言  95-96
    材料与方法  96-100
      1 研究对象、主要仪器设备与试剂  96-97
      2 荧光定量 PCR 法检测血清中 miRNA-92 的水平  97-100
      3 统计学分析  100
    结果  100-102
      1 上皮性卵巢癌患者血清与对照组血清 miR-92 的表达  100-101
      2 上皮性卵巢癌血清中 miR-92 和临床病理特征的关系  101-102
    讨论  102-106
    结论  106-107
  课题创新性总结  107-109
参考文献  109-135
作者简介及在学期间所取得的科研成果  135-137
致谢  137

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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