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新型“适配子—脂质体”siRNA靶向入胞递送系统的构建及其应用于前列腺癌治疗的实验研究

作　者: 王啸林
导　师: 宋海峰; 王清清
学　校: 广西医科大学
专　业: 药理学
关键词: 脂质体 siRNA 适配子 PSMA
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


前列腺癌是目前男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率逐年上升也严重影响男性健康。早期诊断和手术切除是目前治疗前列腺癌较为有效的方法,但是手术切除治疗效果有限。随着近年来生物化学与分子生物学的快速发展,如何在分子水平去认识和治疗疾病逐渐成为人们关注的焦点,人们认识到只有从肿瘤的发生发展机制方面来治疗恶性肿瘤,才是彻底根治的唯一途径。因此,研究探索新型、安全、高效的前列腺癌基因治疗方法具有十分重要的临床意义和应用价值。目前常用于基因治疗研究及临床应用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体由于其潜在的致病性、免疫原性及大规模生产制备困难等缺点,使其应用受到局限。非病毒载体优点包括毒性低,制备方法简单等,但存在转染效率低,靶向性差等问题。因此设计高靶向性的低毒高效的递送系统是当前抗肿瘤研究的热点之一。本课题针对前列腺癌基因治疗时体内递送的难题,从靶向递送和安全包裹两方面着手--采用新型转录方法制备具有特异性识别前列腺特异性膜抗原(PSMA)的寡核苷酸适配子,并对其进行化学修饰,用反向蒸发等技术制备脂质体用以包裹有确切沉默效果的siRNA,然后通过特异的合成方法将寡核苷酸适配子和脂质体-siRNA二者有机结合,从而构建可特异性识别PSMA的新型“适配子-脂质体”siRNA体内靶向入胞递送系统。通过透射电镜及激光粒度仪对于递送系统的形态学及理化性质进行测定；以PSMA特异性抗体为阳性对照,进一步通过流式细胞术考察递送系统靶向性及与靶细胞的亲和性,使用Plk-1作为靶基因,体外细胞水平全面评价该系统的稳定性、靶向性与有效性,通过荧光显微镜观察适配子-脂质体-siRNA复合物的入胞效率,RT-PCR测定靶基因的沉默效应。研究结果显示,首先,成功构建了脂质体-siRNA复合物,其粒径为117±4.3nm, Zeta电位为47±3.6mV；成功改进了RNA适配子的转录方法,与传统方法相比,转录效率提高约100倍；成功对适配子进行化学修饰,并证明修饰后转录效率无明显降低；通过“后插入法”成功将适配子与脂质体-siRNA复合物进行偶联,制备适配子-脂质体-siRNA复合物,其粒径为151±6.1nm,Zeta电位为40±5.8mV；所制备适配子-脂质体-siRNA复合物具有较高靶向性及亲和性,且亲和性强于PSMA特异性抗体；荧光显微镜观察递送系统转染效率高于商品化脂质体,RT-PCR结果显示沉默效率较高。上述结果表明,成功构建了新型“适配子-脂质体”siRNA靶向入胞递送系统,同时具有较高的细胞靶向性及基因沉默效率,为siRNA的体内应用及前列腺癌的治疗提供理论和实验依据,同时为恶性肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-17
第一部分： 新型脂质体-siRNA体系的构建及评价  17-33
  一. 材料与方法  18-23
    1. 材料  18-21
      1.1 主要试剂  18
      1.2 细胞株  18
      1.3 主要仪器设备  18-20
      1.4 主要试剂配方  20-21
    2. 方法  21-23
      2.1 阳离子脂质体的制备及理化性质的分析  21
      2.2 透射电镜观察脂质体形态  21
      2.3 细胞转染实验  21-22
      2.4 荧光显微镜观察脂质体包裹siRNA入胞情况  22
      2.5 RT-PCR考察复合物靶mRNA的沉默效应  22
      2.6 肿瘤细胞生长抑制率测定  22-23
  二. 结果与分析  23-30
    1. 阳离子脂质体制备及条件优化  23-25
    2. 新型脂质体siRNA复合物形态学考察  25-26
    3. 基因沉默效应  26-27
    4. 荧光显微镜观察siRNA入胞效果  27-28
    5. 细胞毒性评定  28-30
  三. 讨论  30-32
  四. 小结  32-33
第二部分： 寡核苷酸适配子介导的脂质体-siRNA递送系统的构建及评价  33-61
  一、材料与方法  35-43
    1. 材料  35-37
      1.1 主要试剂  35
      1.2 DNA模板  35-36
      1.3 主要仪器设备  36-37
      1.4 主要试剂配方  37
    2. 方法  37-43
      2.1 RNA适配子转录  37-39
      2.2 转录后RNA适配子化学修饰及纯化  39-40
      2.3 PEG化适配子的回收  40
      2.4 后插入法制备适配子-脂质体-siRNA复合物  40
      2.5 透射电镜观察适配子-脂质体-siRNA复合物形态  40-41
      2.6 细胞转染实验  41
      2.7 加入DHT培养后细胞转染实验  41
      2.8 荧光显微镜观察递送系统包裹siRNA入胞情况  41
      2.9 RT-PCR考察递送系统靶mRNA的沉默效应  41-42
      2.10 适配子-脂质体-siRNA递送系统细胞亲和性测定  42
      2.11 肿瘤细胞生长抑制率测定  42-43
  二、结果与分析  43-56
    1. RNA适配子不同转录方法的比较  43-44
    2. 转录后A10适配子PEG化修饰  44
    3. 不同纯化方法对PEG-A10回收率的影响  44-45
    4. 流式细胞术测定A10适配子的亲和性  45-47
    5. 适配子-脂质体-siRNA复合物制备及条件优化  47-48
    6. 适配子-脂质体-siRNA复合物的形态学考察  48
    7. 基因沉默效应  48-52
    8. 荧光显微镜观察siRNA入胞效果  52-53
    9. 适配子-脂质体-siRNA复合物细胞特异性亲和性测定  53-54
    10 细胞毒性评定  54-56
  三. 讨论  56-59
  四. 小结  59-61
全文总结  61-63
参考文献  63-69
综述 适配子介导SiRNA靶向递送系统的研究进展'  69-85
  References  81-85
附录 中英文缩略词表  85-87
致谢  87-89
攻读学位期间发表的学术论文目录  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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