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人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞生物学行为特性及其分子机制的体外研究

作　者: 邢增术
导　师: 肖亚军; 邢毅飞
学　校: 华中科技大学
专　业: 泌尿外科
关键词: 人肾细胞癌 ACHN 失巢凋亡抵抗 模型 生物学行为 抗失巢凋亡 分子机制 siRNA TrkB Sorafenib
分类号: R737.11
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma，RCC）是最为常见的泌尿系肿瘤之一，占肾脏恶性肿瘤的80%~90%，而透明细胞癌是RCC的主要病理类型。远处转移是RCC患者死亡的主要原因。RAF-MEK-ERK、PI3K-Akt信号转导通路的活化及Mcl-1、TrkB基因表达的上调在肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗中扮演着重要的角色，而失巢凋亡抵抗又与肿瘤细胞的存活和转移密切相关，被认为是肿瘤细胞发生转移的先决条件。那么，RCC肿瘤细胞的存活和转移是否与失巢凋亡抵抗有关？其机制如何，是否与上述分子事件有关联？发生了上述分子事件的RCC肿瘤细胞，其生物学行为特性是否随之发生改变？目前，关于人肾细胞癌抗失巢凋亡分子机制方面的研究很少。基于此，我们设计了本实验。本研究以人肾细胞癌ACHN细胞株为研究对象，初步建立人肾细胞癌失巢凋亡抵抗细胞模型。并以RAF-MEK-ERK、PI3K-Akt信号转导通路及Mcl-1、TrkB为研究靶点，以RAF-MEK-ERK信号转导通路抑制剂Sorafenib及受体TrkB的特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a为处理因素，采用siRNA靶向沉默TrkB基因的方法，体外研究人肾细胞癌ACHN细胞株发生失巢凋亡抵抗后其生物学行为特性的改变及其可能的分子机制，以期为预防和治疗RCC的转移提供新的思路和途径。全文共分三个部分：目的:建立一种稳定可靠的人肾细胞癌ACHN细胞株失巢凋亡抵抗模型，并观察其形态学及生物学行为特性方面的变化。方法:采用超低粘附培养板悬浮培养后重贴壁的方法，诱导获得人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞，倒置相差显微镜观察其形态学改变；AO（吖啶橙）/EB（溴乙锭）双染色法观察ACHN贴壁培养和悬浮培养的凋亡情况；MTT法、平板克隆形成实验、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测凋亡率、划痕实验及Transwell实验检测诱导获得的人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞生物学行为特性方面的变化。结果:悬浮培养的人肾细胞癌ACHN细胞株聚集成簇生长，重贴壁培养后细胞由排列整齐、形状规则的梭形变成有较多突起、排列紊乱的不规则多角形。人肾细胞癌ACHN细胞株贴壁培养和悬浮培养72h后，AO/EB双染色后在荧光显微镜下观察，可见贴壁培养的ACHN细胞生长良好，而悬浮培养的ACHN细胞则大量凋亡。ACHN失巢凋亡抵抗细胞的增殖力、克隆形成能力、抗失巢凋亡能力、细胞迁移力和侵袭力均显著高于ACHN亲本细胞（P＜0.05）。结论:采用超低粘附培养板悬浮培养后重贴壁的方法可建立一种稳定的人肾细胞癌ACHN细胞株失巢凋亡抵抗模型；诱导获得的ACHN失巢凋亡抵抗细胞的增殖力、克隆形成能力、抗失巢凋亡能力、细胞迁移力和侵袭力均显著高于ACHN亲本细胞。目的:研究人肾细胞癌ACHN细胞株发生失巢凋亡抵抗的分子机制。方法:以Sorafenib及K252a为处理因素，采用MTT法、平板克隆形成实验、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测凋亡率、划痕实验及Transwell实验等方法比较不同处理因素对人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞生物学行为特性的影响。应用Real-time PCR方法比较ACHN亲本细胞和失巢凋亡抵抗细胞存活与转移相关基因的mRNA相对量，采用Western blot方法检测ACHN亲本细胞、ACHN失巢凋亡抵抗细胞及不同处理因素对其细胞信号转导通路及细胞存活与转移相关基因蛋白表达水平的影响。结果:1、不同因素处理ACHN失巢凋亡抵抗细胞72h后，与阴性对照组比较，Sorafenib组、K252a组及Sorafenib+K252a组的增殖力、克隆形成能力、抗凋亡能力、细胞迁移力和侵袭力等生物学行为特性明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与Sorafenib组及K252a组相比， Sorafenib+K252a组的上述生物学行为特性也明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。但Sorafenib组与K252a组相比，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。2、与ACHN亲本细胞相比，ACHN失巢凋亡抵抗细胞存活与转移相关基因如MCL-1、TrkB、MMP9、VEGF等的mRNA相对量明显增高，差异在统计学上有显著意义（P＜0.05）。3、与ACHN亲本细胞阴性对照组（不予任何处理）比较，ACHN失巢凋亡抵抗细胞阴性对照组（不予任何处理）的细胞信号通路蛋白如p-ERK、p-AKT等及细胞存活和转移相关蛋白如MCL-1、TrkB、VEGF、MMP9等表达水平明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同因素处理ACHN失巢凋亡抵抗细胞72h后，与失巢凋亡抵抗细胞阴性对照组相比，失巢凋亡抵抗细胞Sorafenib处理组、K252a处理组和Sorafenib+K252a处理组的上述蛋白表达水平明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与失巢凋亡抵抗细胞Sorafenib处理组和K252a处理组比较，Sorafenib+K252a处理组的上述蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。但失巢凋亡抵抗细胞Sorafenib处理组与K252a处理组上述蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1、RAF-MEK-ERK信号传导通路及VEGFR的抑制剂Sorafenib，以及TrkB的特异性抑制剂K252a可明显影响人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞的生物学行为特性，且两者可能存在相加或协同效应。2、人肾细胞癌ACHN株由亲本细胞诱导转化为高增殖、抗失巢凋亡、高转移潜能的失巢凋亡抵抗细胞，与PI3K-AKT和RAF-MEK-ERK蛋白激酶信号通路的活化、以及细胞存活和转移相关蛋白MCL-1、TrkB、MMP9、VEGF等表达的上调密切相关。目的:进一步证实TrkB基因与人肾细胞癌ACHN细胞株发生失巢凋亡抵抗进而导致存活和转移之间的关系。方法:设计并人工化学合成的3条靶向TrkB-mRNA的siRNA转染进入人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞中，Real-time PCR及Western blot方法分别检测TrkB-mRNA相对量及其蛋白表达水平，筛选出最有效的靶向TrkB-mRNAsiRNA用于后续实验；采用MTT法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测凋亡率、划痕实验、Transwell实验及Western blot等方法，检测以最有效的siRNA沉默TrkB基因后，ACHN失巢凋亡抵抗细胞生物学行为特性及其存活和转移相关蛋白如p-AKT、MCL-1、VEGF和MMP9等表达水平的变化；TrkB（NTRK2）-siRNA3靶向沉默TrkB基因48h后，予低于阈浓度的Sorafenib（1.0μmol/L）处理ACHN失巢凋亡抵抗细胞，分别应用MTT法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪及Western blot等方法检测其增殖率、凋亡率及MCL-1蛋白表达水平。结果:1、在3个候选的NTRK2-siRNA中，NTRK2-siRNA3组的TrkB mRNA相对量及蛋白表达水平降低最明显，与其它各组比较，差异在统计学上均有显著意义（P＜0.05）。2、TrkB（NTRK2）-siRNA3靶向沉默人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞TrkB基因48h后，其增殖力、抗凋亡能力、细胞迁移力和侵袭力等生物学行为特性明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组比较，转染NTRK2-siRNA348h后ACHN失巢凋亡抵抗细胞p-AKT、MCL-1、VEGF和MMP9等蛋白表达水平明显下调，两者的差异有统计学意义（P＜0.05）。3、Sorafenib（1.0μmol/L）处理组与空白对照组比较，其增殖率、凋亡率及MCL-1蛋白表达水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。Sorafenib（1.0μmol/L）处理组、转染NTRK2-siRNA3组和转染NTRK2-siRNA3+Sorafenib（1.0μmol/L）处理组之间两两比较，三者之间增殖率、凋亡率及MCL-1蛋白表达水平的差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:1、TrkB（NTRK2）-siRNA3可有效干扰人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞TrkB基因的表达，可用于后续实验。2、NTRK2-siRNA3靶向沉默人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞TrkB基因的表达，可抑制PI3K-Akt信号通路活性，下调MCL-1、VEGF、MMP9等细胞存活及转移相关基因的表达，进而影响其生物学行为特性。3、NTRK2-siRNA3靶向沉默TrkB基因可提高Sorafenib对人肾细胞癌ACHN失巢凋亡抵抗细胞治疗的敏感性。其分子机制与TrkB基因沉默后，Sorafenib抑制MCL-1表达的敏感性提高有一定关系。

全文目录


中文摘要  6-11
Abstract  11-17
主要英文缩略词表  17-19
前言  19-22
第一部分 人肾细胞癌 ACHN 失巢凋亡抵抗细胞模型的建立及其基本生物学行为特性的研究  22-43
  材料与方法  22-31
  结果  31-39
  讨论  39-42
  结论  42-43
第二部分 人肾细胞癌 ACHN 细胞株抗失巢凋亡分子机制的体外研究  43-79
  材料与方法  44-62
  结果  62-74
  讨论  74-78
  结论  78-79
第三部分 siRNA沉默 TrkB基因对人肾细胞癌 ACHN失巢凋亡抵抗细胞生物学行为特性及 Sorafenib 治疗敏感性的影响  79-115
  材料与方法  80-96
  结果  96-111
  讨论  111-114
  结论  114-115
参考文献  115-122
附录 1 发表论文目录  122-123
附录 2 综述  123-130
  参考文献  129-130
致谢  130

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 泌尿器肿瘤 > 肾、肾盂肿瘤
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