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大鼠肝脏缺血再灌注后miR-146a表达的研究

作　者: 陈启
导　师: 孔连宝
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: miR-146a Toll样受体4 缺血再灌注肝重组人促红细胞生成素再灌注损伤肝脏诱导型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶
分类号: R657.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部分miR-146a在大鼠肝脏缺血再灌注损伤早期表达下调的研究缺血再灌注（Ischemia Reperfusion IR）损伤常发生在临床各种过程中如：肝移植，肝切除术，失血性休克和弥漫性血管内凝血。肝脏对再灌注损伤高度敏感，但是，这种损伤的机制尚未完全确定。Toll样受体4（TLR4）作为一种先天免疫受体，近期多项实验研究证实TLR4在肝、肾、心等缺血再灌注损伤机制中起重要作用。当TLR4与配体结合后能引发一系列的炎症反应，并能诱导树突状细胞（DCs）的成熟，促进T细胞产生，在缺血再灌注中有重要作用。干预TLR4引发的信号途径可能是减轻IR损伤重要策略。近年来TLR4在肝脏IR损伤的研究中倍受关注。由于其关键作用，在免疫反应和血管活性肠肽（VIP）下调TLR4表达可以减轻肝脏缺血再灌注损伤。微小RNA（miRNA）是一类21-23个核苷酸的非编码小分子RNA，它起到基因表达调控的作用。miRNA在线虫、果蝇、植物、哺乳动物，甚至病毒中广泛存在。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用如：发育、分化、生长、增殖、凋亡、代谢的动态平衡。 miRNA是通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域（3’-untranslated region,3’ UTR）互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制或是诱使mRNA裂解，从而下调其蛋白产物的表达水平。miR-146a作为一个最重要的miRNA，已被证明在炎症的发生和反应中是关键分子之一。目前研究暂无数据证实miR-146a在肝脏缺血再灌注（IR）损伤的表达。目的：探讨miR-146a在肝脏缺血再灌注损伤中的表达以及miR-146a和TLR4信号通路在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型之间的关系。方法：建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。实时荧光定量PCR检测miR-146a的表达。Western blotting印迹法检测肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、TLR4和白介素-1受体相关激酶-1（IRAK1）蛋白的表达。同时也检测被TLR4诱导的信号通路。结果：miR-146a在肝脏再灌注后24小时内表达下调，并且在再灌注6小时后达到高峰。我们还发现了，再灌注后24小时内， TLR4、TRAF6和IRAK1表达的升高伴随了miR-146a的下降，并且在再灌注后6小时达到高峰。免疫组化显示了再灌注后TLR4阳性细胞的细胞质和细胞核的NF-κB p65和c-jun表达也在增加。结论：miR-146a在肝缺血再灌注损伤的早期阶段表达下调，并且可能通过TLR4介导的信号通路调节肝脏缺血再灌注损伤。第二部分重组人促红细胞生成素生成素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究促红细胞生成素（erthrpoietin, EPO）是一种肽类激素。在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子。能刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白和红细胞的成熟。主要用于治疗多种原因所致的贫血。EPO促进红细胞生成的生物学效应是通过位于骨髓红系祖细胞表面的特异性EPO受体（EPOR）介导完成。EPO与EPOR结合后，EPOR形成二聚体，再通过信号传导途径调节红系的增生和分化。EPO不仅有经典内分泌途径还可通过自分泌和旁分泌的方式发挥组织特异性作用，是具有多种功能的激素和细胞因子。近年来其非造血生物作用逐渐引起关注， EPO具有多种器官及组织保护及抗炎作用。炎症反应参与了各种损伤，而EPO可减少许多致炎因子的释放，减轻炎性细胞的浸润，还可激活内源性保护机制，从而发挥重要的抗炎作用。EPO的保护作用可能与上调抗凋亡基因表达、抑制炎症、减轻一氧化氮（NO）介导的损伤及直接的抗氧化效应等有关。1985年重组人红细胞生成素（rHuEPO）研究成功并广泛应用于临床，大大加速了人们对EPO的基础及应用研究。有研究报道，rHuEPO能减轻多种器官和组织的缺血再灌注（IR）损伤，但rHuEPO在肝脏IR损伤中的研究甚少。目的：探讨重组人促红细胞生成素（rHuEPO）对大鼠肝脏缺血再灌注（IR）后的保护作用及可能机制。方法：将30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组（A组）、模型组（B组）、处理组（C组）3组，每组10只。B组和C组建立70%大鼠肝脏IR损伤模型（缺血1h，在灌注6h），待B组和C组灌注6h时测定各组血清ALT，AST的变化，HE染色光镜下组织学观察。应用Western blotting及RT-PCR检测肝脏诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达。结果：与A组相比，B组细胞上清液中ALT，AST含量明显升高（P＜0.01），C组的ALT，AST显著低于B组（P＜0.01）。A组有少量iNOS表达，B组iNOS表达升高（P＜0.05）而C组表达减少，与B组相比差异有显著性意义（P＜0.05）。而eNOS在B组和C组中的表达无差异（P＞0.05）。结论：rHuEPO能抑制iNOS的表达以减少肝细胞坏死，减轻大鼠肝脏IR损伤，从而对肝脏有保护作用。

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中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
第一部分 miR-146a 在大鼠肝脏缺血再灌注损伤早期表达下调的研究  13-34
  前言  13-14
  材料与方法  14-22
  结果  22-27
  讨论  27-30
  参考文献  30-34
第二部分重组人促红细胞生成素生成素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究  34-51
  前言  34-35
  材料与方法  35-42
  结果  42-45
  讨论  45-47
  参考文献  47-51
文献综述  51-64
  参考文献  57-64
附录：中英文缩写对照表  64-65
攻读学位期间发表文章情况  65-66
致谢  66

大鼠肝脏缺血再灌注后miR-146a表达的研究

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