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1.研究背景及目的当今世界,随着经济的高速发展和工业化进程的加速,人类健康面临非传染性疾病的威胁正日益增加,糖尿病患病率和糖尿病患病数量急剧上升。糖尿病不仅仅是发达国家的“富贵病”,包括中国在内的发展中国家也已成为糖尿病的重灾区。2008年糖尿病流行病学调查结果显示,在中国20岁以上的人群中,年龄标化的糖尿病患病率为9.7%,而糖尿病前期的比例更高达15.5%,推算出全国糖尿病前期的患病人数约1.48亿人。研究显示,糖尿病前期人群是糖尿病的高危群体,5-10年内全世界大约有40%的糖尿病前期人群会发展成糖尿病。一些新诊断的糖尿病前期患者不到3年即有可能转变成糖尿病。糖尿病前期不仅容易发展成糖尿病,还因此大大增加发生心血管事件的风险,其出现心血管事件的相对风险较正常人增加3倍。因此,在糖尿病前期阶段即进行早期干预,是延缓糖尿病病程发生发展的关键阶段,亦是减少今后心血管发生风险的必要过程。2型糖尿病的一级预防的目标是预防2型糖尿病的发生。2型糖尿病发生的风险主要取决于不可改变的危险因素,如年龄、家族史和遗传倾向、种群等等,以及可改变的危险因素的数目和严重度,如饮食、环境、糖耐量异常或合并空腹血糖受损等等。针对后者,近20年来人类开展了许多关于生活方式干预或者药物干预糖尿病前期的临床试验。大型临床试验表明,通过饮食方式的干预能够预防糖尿病发生以及减少心血管事件的发生和降低死亡率。虽然生活方式对延缓糖尿病的发生发展作用颇为显著,然而对大多数人而言,改变即已形成的生活习惯、转变为强化的生活方式有很大的难度,长期维持更是难上加难。因此,更多研究转向于如何针对糖尿病前期进行早期药物干预。这些药物包括二甲双胍、阿卡波糖、噻唑烷二酮类(TZDs)和RAS系统抑制剂等等。虽然它们各自通过不同的作用机制一定程度的改善了糖尿病前期病理生理作用,但同时也带来了一些副作用。诸如增加胃肠道反应、引起骨质疏忪、增加体重和水钠潴留,加重心功能衰竭等等；更为关键的是,这些药物均通过改善机体病理生理过程而发挥作用,而非针对导致糖尿病发病机制的关键因素——胰岛功能逐渐衰竭起到直接的保护作用。在糖尿病前期找寻可针对胰岛β细胞直接保护作用,促进β细胞数量的增殖,减缓β细胞凋亡,及改善胰岛素分泌的药物,可能成为延缓糖尿病发生发展新的干预手段。近年来人们对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的研究不断深入,这种肠道激素以众多机制保护胰岛p细胞,在糖尿病治疗领域具有更为广阔的应用前景。利拉鲁肽作为GLP-1类似物,目前在其系列研究中,能够促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、保护β细胞、改善早期相胰岛素分泌、改善胰岛素敏感性、增加葡萄糖的利用、还具有保护心脏和心血管系统的作用。不同于其他药物的作用机制,利拉鲁肽能够直接作用于β细胞,刺激细胞增殖、诱导细胞再生阻止胰岛细胞凋亡,从而动态调节β细胞数量；在血糖水平低时利拉鲁肽不会诱导胰岛素分泌确保发挥功能的同时不增加低血糖发生的风险。在GLP-1刺激β细胞增殖及胰岛素分泌合成的基础研究中发现,胰腺十二指肠同源盒-1(Pdx-1)作为胰腺生长和胰岛素基因转录调节的关键因子,在给予GLP-1治疗后发现,胰腺和胰岛中Pdx-1mRNA及蛋白表达均有几倍的增加；该基因受到MafA基因调节,它是胰岛素分泌和胰岛结构维护的一个重要的调节因子。利拉鲁肽作用于活体实验动物后是否对这两个重要基因行使调节作用,是本研究较为关注的问题之一。基于利拉鲁肽的治疗可能最终被证实可有效预防糖尿病,我们选用OLETF大鼠进行实验研究,在糖尿病前期给予利拉鲁肽进行干预,除检测糖尿病大鼠糖尿病前期阶段进食量、体重、血糖、胰岛素、血脂及炎症标志物等指标外,还统计各组大鼠的糖尿病发病例数,评估早时相胰岛素分泌功能、计算胰岛素敏感性指数、稳态模型p细胞功能和胰岛素抵抗指数。实验末期通过对大鼠胰腺组织形态学观察,采用分子生物学技术检测胰岛Pdx-1、MafA及凋亡相关基因的表达,以探求利拉鲁肽在糖尿病前期阶段保护胰岛β细胞功能的相关机制。2.实验方法2.1实验动物及分组4周龄雄性OLETF大鼠由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供,同周龄雄性LETO大鼠为其同种系正常对照。每笼4-6只饲养于SPF级环境,环境温度控制在(21±2)℃,湿度为(55±10)%,光照与黑暗12h交替(光照时间：7：00～19：00)。标准饲料喂养,自由进食、饮水。12周龄符合糖耐量异常OLETF (IGT-OLETF)大鼠随机分成4组,每组8只,单笼饲养,各组大鼠分别接受腹腔注射生理盐水或利鲁拉肽(50,100或200μg/kg,诺和诺德制药公司提供),每天早上7：30和晚上7：30,各注射1次,连续注射12周；8只正常LETO大鼠,注射生理盐水,作为正常对照组。实验期间,由于实验灌胃失误,致使3只大鼠死亡,其中100μg/kg剂量组2只,200μg/kg剂量组1只。干预12周实验结束后,禁食15h,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉,切开腹腔摘取完整胰腺,靠近脾脏部分进行胰岛分离,靠近十二指肠部分4%多聚甲醛浸泡,行免疫组化检测。2.2葡萄糖耐量试验(OGTT)在给予药物干预后分别在0,2,4,6,8,10,12周行口服OGTT试验：大鼠禁食15h后,按2g/kg的剂量给予50%葡萄糖溶液灌胃,采用稳豪倍优型血糖仪分别在0,30,60,90和120rmin采取鼠尾静脉血进行血糖测定。2.3糖尿病及糖尿病前期诊断标准糖尿病及糖尿病前期诊断标准参照日本大冢制药株式会社德岛研究所关于OLETF大鼠的实验研究,OGTT测定0,30,60,90和120rmin的血糖,血糖峰值>16.7mmol/L,且120min血糖>11.1mmol/L,诊断为糖尿病,符合上述诊断标准之一的则确诊为糖耐量异常(IGT)。2.4一般情况观察及生化指标检测每周进行大鼠的体重和进食量的测量,观察利拉鲁肽对体重及进食的影响。分别于0,2,4,6,8,10,12周行OGTT。取鼠尾静脉血进行0,30,60,90和120min的血糖测定,根据梯形法计算葡萄糖曲线下面积(G-AUC)。于0和12周尾静脉采血,分离血清,-80-C保存备用,应用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c);采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清超敏C反应蛋白(Hs-CRP),肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6),纤维蛋白原(Fib)和纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)。于0和12周抽取空腹及OGTT30min血清,采用ELISA法检测空腹胰岛素(FINS)和OGTT30min胰岛素(INS30min)。2.5胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能评估计算胰岛素敏感性指数(ISI=1/FBG×FINS);胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FBG×FIns/22.5);胰岛β细胞功能指数[HOMA-β=20×Fins/(FBG-3.5)];早期胰岛素分泌指数为糖负荷后30min胰岛素增量与葡萄糖增量的比值即ΔIns30/ΔGlu30=(Ins30-Ins0)/(Glu30-Glu0)。2.6胰岛分离、纯化及鉴定采用戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉,经胆总管逆行注入D-Hank’s液,迅速摘取胰腺,移入含有0.8mg/mL胶原酶P溶液消化。将胰腺消化物加入25%Ficoll混匀后,依次加入23%、20%和11%Ficoll-400溶液,4℃离心收集胰岛,显微镜下手工挑取胰岛,-80℃储存备用。2.7实时荧光定量PCR检测采用。Trizol试剂盒提取胰岛总RNA,反转录合成cDNA。PCR反应：采用SYBRGreenⅠ荧光标记,ABI7500实时定量PCR仪上进行实时定量PCR反应。检测的基因包括Pdx-1、MafA、 Bax、 Bcl-2、Caspase3和IL-1p,引物由上海英俊生物技术有限公司合成。进行每一个基因PCR定量反应时,同时将目的段基因相应基因样品作为标准品梯度稀释构建标准曲线。PCR扩增反应条件：94℃5min,94℃30s,60℃30s,72℃7min,共30个循环。2.8Westernblot检测免疫印迹采用兔抗Pdx-1、兔抗MafA、兔抗Caspase3和兔抗IL-1p多克隆抗体。聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹分析根据说明书操作。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗IgG室温孵育1h,洗膜后DAB显示条带。Universal hood Ⅱ凝胶成像系统拍照。通过凝胶图像分析系统分析蛋白表达量。2.9胰腺组织学观察靠近十二指肠部分的胰腺用4%多聚甲醛浸泡过夜,用石蜡进行包埋。5μm厚度石蜡切片用于HE染色和免疫组化染色。免疫组化采用SABC三步法对切片进行染色。3.统计分析实验数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析,数据用均数加减标准误描述(x±SEM)。重复测量数据多组间比较采用重复测量方差分析,组间两两比较采用Bonferroni法；同一时间点多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较方差齐性采用Bonferroni法,方差不齐采用Dunnet’s T3法检验；干预前后数据比较采用配对样本t检验；相关性分析,双变量满足正态分布采用Pearson相关性检验,不满足正态分布的采用Spearman相关性检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。4.结果4.1利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠进食量和体重的影响利拉鲁肽干预前,糖尿病前期OLETF大鼠的进食量(37.01±1.17g/d)较正常LETO大鼠(27.14±0.75g/d)增多,差异具有统计学意义(P<0.0001)。干预12周结束后,不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预组干预后OLETF大鼠的进食量(35.12±1.21,34.78±1.67,35.16+1.00g/d)较为相似,对比LETO大鼠组(25.01±0.5g/d)均有所增多,差异具有统计学意义(P<0.0001)；对比生理盐水干预组OLETF大鼠的进食量(36.77±0.40g/d)仅轻度的减少,但差异无统计学意义(P均>0.05)。干预前OLETF大鼠的体重(416.74±7.21g)对比LETO大鼠(331.91±7.80g)增多(P<0.0001)；利拉鲁肽干预处理1周后,不同药物剂量(50,100,200μg/kg)干预组的OLETF大鼠体重分别为380.16±4.09,365.18±2.97和361.28±7.80g,较干预前都有所减少,对比生理盐水干预组OLETF大鼠的体重426.69±7.61g也均减少,差异具有显著性意义(P均<0.05)。干预后第2周开始,各组大鼠体重均逐渐增加,不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预组的体重(408.81±3.18,395.55±5.15,395.27±9.58g)对比LETO组(350.69±6.93g)均有所增多(P均<0.01)；而对比生理盐水干预组OLETF大鼠(439.14±4.96g),尽管进食量类似,但体重仍明显减少,差异具有显著意义(P均<0.05)。4.2利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠血糖代谢和胰岛素敏感性的影响干预实验结束后,生理盐水干预组8只OLETF大鼠有7只(87.5%)发展成糖尿病,利拉鲁肽干预组21只大鼠均没有糖尿病发生,有9只(42.9%)早期糖耐量异常的大鼠空腹及餐后血糖恢复正常。干预前,IGT-OLETF大鼠的空腹血糖(FPG)为6.68±0.07mmol/L,糖耐量后2小时血糖(2hPG)为7.21±0.19mmol/L,葡萄糖曲线下面积(G-AUC)为666.21±40.59Mm*min/L; LETO大鼠FPG为5.23±0.10mmol/L,2hPG为6.64±0.14mmol/L, G-AUC为306.00±27.37Mm*min/L。IGT-OLETF大鼠的FPG、2hPG和G-AUC较LETO大鼠均升高。LETO大鼠的FPG、2h-PG和G-AUC整个实验期间均维持稳定,生理盐水干预组OLETF大鼠则均逐渐升高；干预处理2周后,不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预组OLETF大鼠的FPG分别为5.75±0.28mmol/L、5.33±0.13mmol/L和15.43±0.23mmol/L,2hPG分别为6.82±0.18mmol/L,6.73±0.28mmol/L和7.09±0.34mmol/L,G-AUC分别为306.55±41.97Mm*min/L、292.92±42.09Mm*min/L和306.19±57.80Mm*min/L,对比生理盐水干预组OLETF大鼠(FPG,6.51±0.08mmol/L,2hPG,7.44±0.22mmol/L, G-AUC,573.14±49.59Mm*min/L,P均<0.05)均降低,之后一直维持在与LETO大鼠相似的水平。另外,本研究相关性分析显示,生理盐水干预组OLETF大鼠的FPG与进食量(干预2w,R=-0.307,P=0.460；干预12w,R=0.369,P=0.369)和体重增加无明显相关性(干预2w,R=-0.245,P=0.559；干预12w,R=0.153,P=0.718),而干预12周后,2h-PG与体重增加成明显正相关(R=0.784,P=0.021)。干预前,对比LETO大鼠(FINS,27.21±0.36μIU/mL, HOMR-IR,6.32±0.17,ISI,7.06±0.18, HOMA-p,323.46±20.63, ΔIns30/AGlu30,11.23±0.85), IGT-OLETF大鼠的空腹胰岛素(FINS,37.49±0.78μIU/mL)和HOMR-IR (10.83±0.31)升高(P均<0.0001),胰岛素敏感性指数(ISI,4.12±0.12)减少(P<0.0001), HOMA-β (251.92±9.82)和ΔIns30/AGlu30(5.21±0.40)减少(P均<0.05)；各组大鼠的葡萄糖耐量后30分钟胰岛素(INS30min)水平均升高,LETO组大约增加3倍,而OLETF大鼠大约增加2.5倍。24周龄时,生理盐水干预组OLETF大鼠的FINS (51.03±1.12μIU/mL)和HOMR-IR (19.55±0.87)进一步增加(vs干预前,P均<0.001),ISI (2.37±0.09)、HOMA-β (205.75±4.20)和ΔIns30/AGlu30(3.85±0.19)进一步减少(vs干预前,P均<0.05)。不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预组干预后OLETF大鼠FINS (39.86±0.94,38.19±1.00,37.03±1.21μIU/mL)、HOM-IR (11.27±0.36,10.54±0.28,10.40±0.48)、ISI (4.06±0.11,4.34±0.11,4.73±0.20)、HOMA-β (290.99±12.79,288.62±11.23,294.41±14.24)及ΔIns30/ΔGlu30(9.00±0.35,8.90±0.37,9.55±0.25)的异常对比生理盐水干预组OLETF大鼠均有所改善(P均<0.05),尤其是ΔIns30/AGlu30对比干预前恢复(P<0.05)。生理盐水干预组OLETF的INS30min水平增加大约2倍,而各种剂量利拉鲁肽干预组和LETO组均增加3倍。4.3利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠血脂代谢的影响与LETO大鼠对比,生理盐水干预组OLETF大鼠的血清总胆固醇(TC)12周龄(LETO大鼠,2.59±0.05vs OLETF大鼠,3.01±0.05mmol/L,P=0.003)和24周龄时(LETO大鼠,2.02±0.07vs OLETF大鼠,2.56±0.08mmol/L,P=0.006)均升高；24周龄时,血清甘油三酯(TG)升高具有统计学意义(LETO大鼠,0.36±0.04vs OLETF大鼠,1.09±0.06mmol/L, P<0.0001)。干预12周后,不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预组OELTF大鼠的TC分别为2.21±0.02、2.24.±0.05和2.13±0.02mmol/L,对比干预前(2.84±0.04,3.05±0.12,2.94±0.02mmol/L)降低具有显著性意义(P均<0.01),与生理盐水干预组OLETF大鼠(2.56±0.08mmol/L)对比均减少,差异具有统计学意义(P=0.006)；而TG分别为0.71±0.04、0.40±0.13和0.51±0.03mmol/L,较干预前(0.55±0.04,0.70±0.10,0.64±0.02mmol/L)差异无明显统计学意义,与生理盐水干预组OLETF大鼠(1.09±0.06mmol/L)对比降低具有显著性意义(P<0.0001)。干预前和干预后,各组之间HDL和LDL差异无显著性意义(P均>0.05)。4.4利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠血清炎症指标的影响干预前,糖尿病前期OLETF大鼠的血清纤维蛋白原(Fib)为74.04±1.66U/mL、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)为48.90±2.62ng/mL、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)为5.53±0.17ng/mL、白细胞介素-6(IL-6)为8.89±0.27pg/mL、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)为48.67±3.01ng/mL,对比LETO大鼠(Fib,55.38±1.92U/mL, TNF-α,31.70±3.00ng/mL, Hs-CRP,3.56±0.16ng/mL, IL-6,5.11±0.38pg/mL, PAI-1,26.45±1.54ng/mL)均升高差异具有显著性意义(P均<0.001)。12周后,对比干预前PAI-1和Fib进一步升高(PAI-1：干预前48.67±3.01vs干预后63.37±0.99,P=0.026；Fib：干预前74.04±1.66vs干预后94.20±1.32,P=0.003)。不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预12周后,对比干预前,各种剂量组的IL-6降低(50μg/kg组,干预前8.18±0.20vs干预后5.63±0.32pg/mL,100μg/kg组,干预前8.18±0.56vs干预后4.79±0.90pg/mL,200μg/kg组,干预前8.30±0.22vs干预后5.11±0.26g/mL,P均<0.05),而Hs-CRP只有高剂量组(200μg/kg组,干预前5.39±0.07vs干预后3.68±0.12ng/mL, P=0.006)和PAI-1只有低剂量组(50μg/kg组,干预前50.42±2.04vs干预后27.74±3.19ng/mL, P=0.026)降低,但对比生理盐水干预组OLETF大鼠,各种剂量利拉鲁肽干预组的Fib、 TNF-α、 Hs-CRP、 IL-6和PAI-1均降低(P均<0.01),详见表4-4。进一步相关性分析显示,干预12周后,生理盐水干预组OLETF大鼠的体重增多与血清Hs-CRP(R=0.794, P=0.018),血清TG与PAI-1(R=0.881,P=0.004)均呈正相关。而在利拉鲁肽干预组中无此关系。4.5利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠胰岛转录因子和凋亡因子表达的影响干预实验结束时,对比LETO大鼠(Pdx-1,7.06±1.07, MafA,3.18±0.42, Bc12,29.92±1.72, Bax,5.49±0.53, Caspase3,84.48±3.39),生理盐水干预组OLETF大鼠的胰岛Pdx-1(2.19±0.44)、MafA (0.62±0.01)和Bc12(8.22±1.62) mRNA水平均减少(P均<0.05), Bax (29.74±3.74)和Caspase3(406.63±62.88) mRNA水平均明显均增多(P均<0.05)。而不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预后,明显增加了Pdx-1(3.60±0.88,5.87±1.03,3.77±1.05)、MafA(0.76±0.04,1.54±0.06,3.20±0.13)和Bc12(15.13±1.41,16.35±1.14,19.96±1.80) mRNA水平,阻止Bax (15.16±2.26,7.22±0.80,7.18±0.32)和Caspase3(205.58±5.40,163.90±32.81,153.41±7.91) mRNA水平的升高。对比LETO大鼠(Pdx-1,0.62±0.09, MafA,0.60±0.05, Caspase3,0.31±0.09),生理盐水干预组OLETF大鼠的胰岛Pdx-1(0.21±0.03)和MafA (0.14±0.03)蛋白水平减少(P<0.05), Caspase3(0.87±0.07)蛋白水平增多(P均<0.05),而不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预后,前两者(Pdx-1,0.42±0.01,0.45±0.04,0.44±0.04, MafA,0.30±0.04,0.42±0.02,0.51±0.05)表达增加,后者(Caspase3,0.42±0.02,0.46±0.07,0.36±0.04)减少。4.6利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠胰岛炎症因子IL-1p表达的影响干预实验结束时,RT-PCR及WB结果分析显示,对比LETO大鼠,生理盐水干预组OLETF大鼠的胰岛IL-1βmRNA (15.39±0.60vs31.78±1.92)和蛋白(0.24±0.05vs0.78±0.02)水平均增加(P均<0.0001),而不同剂量利拉鲁肽(50,100,200μg/kg)干预后,IL-1βmRNA (20.56±2.27,16.38±1.06,15.60±1.17)和蛋白(0.39±0.012,0.27±0.02,0.26±0.01)表达减少,具有一定的浓度依赖性。4.7利拉鲁肽对IGT-OLETF大鼠胰岛结构的影响光镜下可见,LETO大鼠胰岛与外分泌腺之间边界清楚。OLETF大鼠胰岛边界不规则,胰岛细胞增生,部分细胞肥大,间质纤维细胞增生,胰岛周围少量炎症细胞浸润。利拉鲁肽干预组,胰岛结构与LETO大鼠相似,胰岛边界清楚,无明显炎症细胞浸润。见图4-7。4.8光镜下观察大鼠胰岛胰岛素及IL-1p的表达光镜下观察到腆岛素及IL-1p均表达于细胞胞浆中,对比LETO大鼠,OLETF大鼠胰岛素含量明显减少,而IL-1β明显增多,利拉鲁肽干预处理后,胰岛素含量明显增多,IL-1β明显减少。见图4-7。5.结论(1) IGT-OLETF大鼠12周龄时表现为血糖升高、肥胖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能受损、高脂血症,炎症指标明显增高状体,是糖尿病前期模型的理想选择。(2)利拉鲁肽对大鼠摄食量具有短暂的抑制作用；其减轻大鼠体重的作用维持时间较长,且不受大鼠进食量的影响。(3)利拉鲁肽能有效改善大鼠糖耐量异常、胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能,同时也降低了大鼠血脂和炎症指标,抑制胰岛局部炎症因子IL-1βmRNA和蛋白表达,提示利拉鲁肽可能通过降低甘油三酯和炎症水平,抑制胰岛炎症因子IL-1β,发挥抗炎作用,改善胰岛素敏感性和胰岛细胞功能,阻止糖尿病发病。(4)利拉鲁肽促进胰岛转录相关因子PdX-1和Mafa mRNA和蛋白表达,上调抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达,下调促凋亡因子Bax mRNA及减少Caspase3mRNA和蛋白的表达。提示利拉鲁肽可能通过胰岛转录相关因子PdX-1和MafA,凋亡因子Bcl-2,Bax及凋亡蛋白酶Caspase3影响的作用维持胰岛β细胞数量,改善胰岛细胞功能。
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