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肠杆菌科中产超广谱β-内酰胺酶菌株的基因型分析

作　者: 张亚兰
导　师: 胡佳杰
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 超广谱β-内酰胺酶 耐药基因 聚合酶链反应 基因分型
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：肠杆菌科细菌成员庞大、最为常见,与人类疾病关系十分密切。肠杆菌科细菌对广谱β-内酰胺类抗生素耐药的常见机制是产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)。苷酸序列分析技术可更加准确客观地了解ESBLs基因亚型间的差异以及发现新的产ESBLs基因,本实验将运用核苷酸序列分析技术了解武汉市第三医院临床分离的肠杆菌科细菌的ESBLs基因型及产ESBLs菌感染现状,为临床合理用药以及延缓耐药控制措施方案的制定提供一定的理论参考。方法：收集武汉市三医院2011年1月至2011年12月临床分离的双纸片协同初筛试验为阳性的产ESBLs肠杆菌科细菌,采用临床实验室标准化协会推荐的标准纸片扩散法表型确证试验(药敏纸片头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸和头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸同时检坝(?)ESBLs)确证ESBLs阳性菌,运用引物设计软件,在TEM、CTX-M型和SHV型耐药基因保守区设计PCR扩增的通用引物,提取待测菌的DNA作为扩增模板,对确证实验ESBLs阳性菌株进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分离,回收纯化PCR扩增产物并进行基因测序,将测序结果与NCBI数据库进行基因比对从而对ESBLs耐药基因进行分型。结果：本实验收集武汉市三医院分离的333株ESBLs初筛试验阳性的肠杆菌科细菌主要来源于创面分泌物,占所有标本的36.6%,其次为痰和尿液标本。运用纸片扩散法表型确证试验确证ESBLs(?)(?)性菌283株,其中大肠埃希菌占67.1%,肺炎克雷伯菌占23.3%,奇异变形杆菌占3.5%,普通变形杆菌占2.2%,阴沟肠杆菌占3.9%。对纸片扩散法表型确证试验确证为ESBLs(?)(?)性菌进行PCR扩增,77.39%(219/283)的细菌扩增出ESBLs耐药基因。CTX-M型占ESBLs(?)日性菌38.17%(108/283),TEM型占ESBLs(?)日性菌23.32%(66/283),15.90%(45/283)的细菌扩增TEM型和CTX-M双重耐药基因,22.61%(64/283)的ESBLs表型确证阳性菌株进行PCR扩增未发现阳性条带。CTX-M-15和TEM-3是主要的耐药基因亚型,其次是CTX-M-3和CTX-M-14群耐药基因。未发现SHV型耐药基因。结论：实验结果表明纸片扩散法表型确证试验与常规PCR扩增试验阳性率一致性高于77.39%；通过武汉市三医院2011年度ESBLs阳性菌全院科室分布统计得出ESBLs阳性菌检出率最高的科室是烧伤科,占全院ESBLs阳性菌24.4%,该院最流行的ESBLs致病菌是大肠埃希菌,其次是肺炎克雷伯菌；通过对纸片扩散法表型确证试验确证ESBLs阳性菌株进行常规PCR扩增,扩增产物进行基因测序,将测序结果在NCBI数据库进行基因比对,同源性均在99%以上。并得出该院最为流行的耐药基因型是CTX-M-15和TEM-3。这些实验结果为临床产ESBLs细菌引起感染的预防和治疗提供可靠参考。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩略词表  9-11
前言  11-13
一、 菌种的收集、活化、鉴定  13-15
  1. 材料与仪器  13
  2. 操作方法  13-15
    2.1 制备LB固体培养基  13-14
    2.2 菌种的收集和活化  14
    2.3 菌株的鉴定  14-15
  3. 结果  15
二、 纸片扩散法ESBLs表型确证试验  15-17
  1. 材料与仪器  15
  2. 操作方法  15-16
  3. 结果  16-17
三、 ESBLs基因PCR扩增  17-21
  1. 材料与仪器  17-18
  2. 操作方法  18-20
    2.1 稀释Oligo DNA  18
    2.2 制备DNA模板  18
    2.3 聚合酶链反应  18-19
    2.4 琼腊糖凝胶电泳鉴定PCR产物  19-20
  3. 结果  20-21
四、 琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物  21-23
  1. 材料与仪器  21-22
  2. 操作方法  22-23
    2.1 试剂盒琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物  22
    2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定回收产物  22-23
  3. 结果  23
五、 DNA测序、基因比对  23-27
  1. 操作方法  23-24
    1.1 DNA测序  23
    1.2 基因比对  23-24
  2. 结果  24-27
讨论  27-32
结语  32-33
参考文献  33-36
综述  36-49
  参考文献  46-49
攻读硕士学位期间发表论文  49-50
致谢  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 微生物学检验
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