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人β防御素的改构及活性研究

作　者: 郭峰
导　师: 高剑峰; 王慧
学　校: 石河子大学
专　业: 遗传学
关键词: 人β防御素杀菌活力盐敏感性透射电镜细胞毒性构效关系原核表达纯化
分类号: R394
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要

目的：以人β防御素（hBDs）为基础，通过改变特定氨基酸序列获得原防御素的突变体，旨在提高其杀菌活力，同时降低盐敏感性，并初步探讨防御素的构效关系与机理。摸索防御素的原核表达途径。方法：（1）Fmoc法合成防御素，对合成后的防御素进行初步的纯度分析以及结构分析。（2）对合成的防御素进行杀菌以及盐敏感性的分析，并应用透射电镜观察防御素的作用方式。（3）用MTT法对合成防御素进行细胞毒性分析，同时通过溶血实验来分析其对血细胞的毒性。（4）将hBD-3进行原核表达纯化。结果：（1）在人β防御素1-4（hBD-1-4）中，hBD-3对测试菌有最强的杀菌活力及最强的耐盐活力，对测试菌株的百分之九十杀死率（LD90）在15μg/ml以下。同时，合成的hBD-1抑菌活力很低，LD90超过100μg/ml。合成的hBD-2,4抑菌活力弱于hBD-3（P＜0.01），但并没有发现明显的对革兰氏阴阳菌的选择性。（2）hBD-3的N端缺失突变体当失去前9个氨基酸时活性及耐盐能力显著下降（P＜0.01），而失去前3个氨基酸的突变体耐盐能力显著提高（P＜0.01）。（3）经过I区替换的改构防御素都有着比hBD-3更强的杀菌活力及耐盐能力，而它们各自的N端缺失突变体杀菌活性及耐盐能力降低。（4）改构体在耐盐能力提高的同时，它们的细胞毒性以及溶血毒性也相应提高。（5）电镜结果显示，防御素作用于细菌后，破坏细胞壁的同时造成质壁分离，导致细菌死亡。（6）成功构建了原核表达载体表达出融合蛋白GST-hBD-3。结论：（1）在hBD1-4中，hBD-3的活性，耐盐能力在所测试的菌株中最强，可以将它作为改构的模板。（2）hBD-3的N端区域对防御素的盐敏感性有着重要作用。（3）hBD-3的I区对防御素杀菌活力有着重要影响。而对于防御素杀菌活性与细胞毒性的关系，需要在后期实验中进一步研究。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
英文缩写词表  7-9
目录  9-11
引言  11-13
第一章文献综述  13-20
  1.1 抗菌肽的发现及应用前景  13-14
  1.2 防御素的研究进展  14-18
    1.2.1 植物防御素（plant defensins）  14-15
    1.2.2 昆虫防御素(insect defensins)  15
    1.2.3 脊椎动物防御素  15-17
    1.2.4 防御素的作用机制  17-18
  1.3 防御素的应用前景  18-19
    1.3.1 通过改造逐步代替抗生素  18
    1.3.2 应用于肿瘤治疗  18
    1.3.3 通过基因工程方法提高宿主动植物的抗感染能力  18-19
  1.4 本实验的研究内容，实验目的和研究意义  19-20
第二章新型防御素的设计及合成  20-27
  2.1 新β防御素的设计  20-21
    2.1.1 实验方法  20
    2.1.2 结果  20-21
  2.2 人β防御素的化学合成及纯化  21-24
    2.2.1 主要试剂及材料  21
    2.2.2 实验方法  21-22
    2.2.3 结果  22-24
  2.3 合成防御素的圆二色谱检测  24-27
    2.3.1 实验材料  24
    2.3.2 实验方法  24
    2.3.3 结果  24-27
第三章人β防御素及其改构体的活性实验  27-42
  3.1 人β防御素对不同菌株的杀菌活力实验  27-29
    3.1.1 实验材料  27
    3.1.2 实验方法  27-28
    3.1.3 结果  28-29
  3.2 人β防御素及其改构体的盐敏感性实验  29-34
    3.2.1 实验材料  29-30
    3.2.2 实验方法  30-31
    3.2.3. 结果  31-34
  3.3 人β防御素对细菌破坏的透射电镜观察  34-38
    3.3.1 实验材料  34
    3.3.2 实验方法  34-35
    3.3.3 实验结果  35-38
  3.4 人β防御素及其改构体的细胞毒性实验（MTT 法）  38-40
    3.4.1 实验材料  38
    3.4.2 实验方法  38-39
    3.4.3 结果  39-40
  3.5 人β防御素及其改构体对红细胞的溶血作用  40-42
    3.5.1 实验材料  40-41
    3.5.2 实验方法  41
    3.5.3 结果  41-42
第四章 hBD-3 在大肠杆菌中的表达纯化  42-50
  4.1 pGX-kg-hBD-3 融合表达载体的构建  42-46
    4.1.1 实验材料  42-43
    4.1.2 实验方法  43-44
    4.1.3 结果  44-46
  4.2 防御素在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  46-50
    4.2.1 实验材料  46
    4.2.2 实验方法  46-47
    4.2.3 结果  47-50
第五章讨论  50-52
第六章结论  52-53
参考文献  53-59
致谢  59-60
作者简介  60-61
导师评阅表  61

人β防御素的改构及活性研究

内容摘要

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