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克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定

作　者: 郝明明
导　师: 杨照青
学　校:
专　业: 病原生物学
关键词: 恶性疟原虫 MSP2 基因突变 pfcrt 抗疟药IC50值抗药性 恶性疟原虫IC50值山梨醇同步化 4℃冷藏同步化
分类号: R382.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探索克钦邦佤邦恶性疟原虫pfcrt基因的多态性方法：1.应用Nest-PCR分别扩增MSP1、MSP2及Glurp基因中具有特异性的片段,进行基因分型,选出单一株。2.应用Nest-PCR扩增pfcrt基因上的两个片段,进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果。结果：1.基因型鉴定：本实验通过对52株样本的MSP1、MSP2、GLURP进行基因型鉴定,获得39株单一感染细胞株。2. pfcrt基因扩增结果：39株样本的pfcrt第71、72、74、75、76、77、97、144、148、152、160、163、194、220位点中,发现第71、72、74、75、76、220号位点存在突变,突变率分别为23.1%、23.1%、92.3%、89.7%、100.0%、100.0%；突变型为V71V、C72S、M74I、N75E、K76T、A220S;第77、97、144、148、152、160、163、194位点未见突变。结论：1.MSP1、MSP2、Glurp基因分型发现有39株样本是单一感染株,其中13株来自克钦邦,26株来自佤邦。2.39株样本的pfcrt的71、72、74、75、76、220号位点存在突变。克钦邦样本CVIETS型的突变率明显高于佤邦(P=0.003<0.05)。目的：测定克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的体外抗药性。方法：将恶性疟原虫的单一株进行体外传代培养,同步化后进行抗疟药(氯喹、哌喹、青蒿琥酯、双氢青蒿素、奎宁)IC50值的测定。结果：13株克钦邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值分别为690.9±243.2nM、65.71±23.8nM、1028±466.5nM、18.8±10.5nM和4.6+3.2nM；26株佤邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值分别为340.1±156.9nM、35.7±21.2nM、385.4±161.8nM、9.4±5.8nM和2.5+1.6nM；8株国际标准株(3D7、HB3、7G8、Dd2、W2、D10、K1和D6)对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素IC50值分别为205.5±225.9nM、15.3±13.2nM、387.0±267.9nM、14.0±6.6nM和2.4±1.8nM。结论：1.氯喹：本实验39株恶性疟原虫中有1/39(25nM≤IC50值<100nM)对氯喹为中度抗性株：有38/39(IC50值≧100nM)为高度抗性株；其中N11-1733和N11-966(IC50值>1000nM)为严重抗药性虫株。氯喹的体外抗药性和pfcrt基因多态性有着密切的关系(P<0.005)。2.哌喹：39株恶性疟原虫中有1/39(F07-12<7.5nM)对哌喹为敏感株；有38/39(IC50值>12.8nM)为抗性株；其中N11-966(IC50值>100nM)为严重抗性株。3.奎宁：39株恶性疟原虫中有22/39(IC5o值<500nM)对奎宁为敏感株；有17/39(IC50值>500nM)为抗性株；其中F07-12(IC50值>2000nM)为严重抗性株。4.青蒿琥酯：不同的参考标准对试验结论的影响较大。本文参考临界值计算公式结合加权法,得出其抗性临界值为29.6nM。39株恶性疟原虫中有38/39(IC50值<29.6nM)对青蒿琥酯为敏感株；有1/39(IC50值>40nM)为敏感性下降株。5.双氢青蒿素：不同的参考标准对试验结论的影响本较大。本文参考药物体外抗性临界值计算公式(均数+2×标准差)结合加权法,得出其抗性临界值为7.7nM。39株恶性疟原虫中有37/39(IC5o值<7.7nM)对双氢青蒿素为敏感株；有2/39(ICso值≧7.7nM)为敏感性下降株。6.交叉抗药性：经研究发现,对于中缅边境地区的恶性疟原虫而言,氯喹和哌喹二者之间,青蒿琥酯、双氢青蒿素及奎宁三者之间存在交叉抗药性。7.克钦邦佤邦39株恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值的研究中发现：两地区样本均不同程度的对氯喹、哌喹和奎宁产生了抗性,且佤邦样本对氯喹、哌喹和奎宁抗性低于克钦邦样本；两地区样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性也不相同,且佤邦样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性大于克钦邦样本。目的：比较4℃冷藏同步化和山梨醇同步化这两种方法对体外测定药物IC50值的影响。方法：按照配对Hotelling T2设计,将8株恶性疟原虫分为两组,分别应用4℃冷藏同步化和山梨醇同步化处理,然后进行4种抗疟药(氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁)IC50值的测定。结果：4℃同步化后得到的8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素、奎宁的IC50值分别为270.8±189.7nM、22.2±12.2nM、1.5±0.9nM和398.4±162.8nM,山梨醇同步化后8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁的IC50值分别为261.0±178.7nM、25.4±15.8nM、1.4±1.0nM和380.7±162.6nM。结论：经配对Hotelling T2检验发现：4℃冷藏同步化方法和山梨醇同步化方法对抗疟药IC50值的影响无显著性差异(P=0.894>0.05)。

全文目录


英文缩略词表  7-9
中文摘要  9-13
  第一部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究  9-10
  第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定  10-12
  第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药抗性体外测定的影响  12-13
ABSTRACT  13-17
  PART1 RESEARCH ON PFCRT OF PLASMODIUMFALCIPARUMISOLATES FROM KACHIN AND WA STATE  13-14
  PART2 EX VTVO DRUG-RESISTANCE ASSAY OF FIVE ANTIMALARIALSON THE ISOLATES FROM WA STATE AND KACHIN STATE  14-16
  PART3 COMPARE THE EFFECTS ON THE EX VIVO DRUG-SENSITIVITYASSAY SEPARATELY TREATED WITH TWO SYNCHRONIZATIONMETHODS -4℃ REFRIGERATION AND 5% SORBITOLUM  16-17
引言  17-22
  1. 疟疾的流行情况  17-20
  2. 抗疟药及抗药性问题  20-22
实验材料与方法  22-47
  1. 实验材料  22-23
  2. 实验仪器、试剂来源及配制  23-28
  3. 试验方法与步骤  28-46
    3.1. 恶性疟原虫的体外培养  28-30
    3.2. MSP2和PFCRT基因的扩增与检测  30-37
      3.2.1. PCR技术的基本原理  30-31
      3.2.2. 实验总路线  31-37
    3.3. 体外抗药性测定  37-44
      3.3.1. 实验原理  37
      3.3.2. 实验要求  37
      3.3.3. 实验总路线  37-38
      3.3.4 恶性疟原虫的配置  38-40
      3.3.5 药板制作  40-43
      3.3.6.IC50值的测定  43-44
    3.4 同步化对比试验  44-46
      3.4.1. 实验总路线  44-45
      3.4.2. 实验具体步骤  45-46
  4. 数据资料统计学分析  46-47
结果  47-68
  第-部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究  47-54
    1. 基因分型结果  47-48
    2. PFCRT基因PCR扩增结果  48-50
    3. PFCRT突变结果  50-54
  第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定  54-65
    1. 体外抗药性测定结果  54-57
    2. 39株病人株和8株国际标准株对5种药物的IC_(50)值综合结果  57-58
    3. 克钦邦和佤邦样本对5种药物的IC_(50)值的比较  58
    4. 五种抗疟药(氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素)之间的交叉抗药性  58
    5. 中缅边境病人株对5种抗疟药物抗性或敏感性的判断  58-61
    6. 氯喹IC_(50)值与PFCRT基因多态性的相关性  61-65
  第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药体外抗性测定的影响  65-68
讨论  68-78
  第一部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究  68-73
  第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定  73-77
  第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药抗性体外测定的影响  77-78
结论  78-79
实验的创新性  79-80
有待深入研究的问题  80-81
参考文献  81-89
附图  89-90
论著  90-111
硕士在读期间发表文章  111-112
致谢  112

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学寄生虫学 > 医学原虫学 > 孢子虫 > 疟原虫
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