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聚阳离子纳米脂质载体的制备及穿膜机理的研究

作　者: 张志文
导　师: 方晓玲
学　校: 复旦大学
专　业: 药剂学
关键词: 烷基化聚乙烯亚胺 三油酸甘油酯 二油酸甘油酯 单油酸甘油酯 卵磷脂 二油酰磷脂酰乙醇胺 聚阳离子纳米脂质载体 网格蛋白 微管 动力蛋白 驱动蛋白 穿膜机理 激光共聚焦显微镜
分类号: R34
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


高效、安全的基因递送载体的研究是目前基因治疗研究的主要难点之一。非病毒基因递送载体由于安全、易组装等特点备受国内外学者的关注。本课题结合磷脂、聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）以及油酸甘油酯的特点,制备了聚阳离子纳米脂质载体（Polycation nanostructured lipid carrier,PNLC）,用于基因递送的研究。本文研究内容包括烷基化聚乙烯合成,PNLC的制备及组分的筛选;PNLC作为绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2和虫荧光素酶报告基因pGL3-luc递送载体的研究;以SPC-A1细胞为模型,采用加入特异性抑制剂的方法,考察PNLC/DNA复合物的细胞内吞途径和转运机制;采用活细胞显微成像技术观察PNLC/DNA复合物进入细胞以及细胞内转运的过程。本文将溴化十四烷、溴化十六烷和溴化十八烷分别与聚乙烯亚胺（PEI600Da,PEI1200Da和PEI1800Da）反应,合成了27种烷基化聚乙烯亚胺,采用乳化溶剂蒸发法制备PNLC,并对制备工艺进行了优化,制备工艺优化为:超声功率200W,超声时间5min,分散介质为双蒸水。PNLC由烷基化聚乙烯亚胺、油相和磷脂三种成分组成。烷基化聚乙烯亚胺为上述合成的27种不同的烷基修饰的聚乙烯亚胺;油相为油酸甘油酯、中链甘油三酯M812、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯和辛酸癸酸甘油酯M818;磷脂为卵磷脂EPC和二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE。采用乳化溶剂蒸发法制备PNLC,测定其粒径和zeta电位,与pEGFP-N2质粒结合形成PNLC/DNA复合物,转染SPC-A1细胞,采用荧光分光光度法测定SPC-A1细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度,以SPC-A1细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度为指标,分别筛选PNLC的各项组成。选择油相为三油酸甘油酯、磷脂为卵磷脂EPC,考察烷基化聚乙烯亚胺对PNLC基因转染效率的影响。结果表明PNLC中烷基化聚乙烯亚胺为十六烷基化聚乙烯亚胺时,与三油酸甘油酯和卵磷脂组成的PNLC转染效率较高,而且当烷基化聚乙烯亚胺为十六烷基化PEI1200（1:6）即P12C16（1:6）时,PNLC在SPC-A1细胞中转染pEGFP-N2后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度与阳离子脂质体LipofectamineTM2000相当。因此,选择PNLC处方中烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）。选择烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）,磷脂为卵磷脂EPC,考察油相对PNLC基因转染的影响。结果表明当油相为油酸甘油酯和中链甘油三酯M812时,制备的PNLC在SPC-A1细胞中转染pEGFP-N2质粒后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度较高。因此,选择PNLC的油相为中链甘油三酯M812和油酸甘油酯（三油酸甘油酯、二油酸甘油酯和单油酸甘油酯）。选择烷基化聚乙烯亚胺为P12C16（1:6）,油相为中链甘油三酯M812、三油酸甘油酯、二油酸甘油酯和单油酸甘油酯,考察磷脂的种类（卵磷脂EPC或者二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE）以及油相/磷脂的比值对PNLC基因转染的影响。结果表明当油相成分为油酸甘油酯时,PNLC在SPC-A1细胞中转染质粒pEGFP-N2后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000。PNLC处方中加入油酸甘油酯后,细胞中表达的绿色荧光蛋白的荧光强度提高。PNLC处方优化结果如下:在由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和卵磷脂EPC组成的PNLC中,P12C16（1:6）与卵磷脂的摩尔比值为0.1,三油酸甘油酯与卵磷脂EPC的摩尔比值为1,二油酸甘油酯与卵磷脂EPC的质量比值为2,单油酸甘油酯与卵磷脂EPC的摩尔比值为6;在由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和磷脂DOPE组成的PNLC中,P12C16（1:6）与磷脂DOPE的摩尔比值为0.1,三油酸甘油酯与磷脂DOPE的摩尔比值为0.8,二油酸甘油酯与磷脂DOPE的质量比值为0.75,单油酸甘油酯与磷脂DOPE的摩尔比值为1.5。上述六种组成PNLC在SPC-A1细胞和CHO细胞中转染质粒pEGFP-N2,流式细胞仪测定其转染效率,结果表明,在SPC-A1细胞和CHO细胞中,由P12C16（1:6）、三油酸甘油酯或者二油酸甘油酯、卵磷脂组成的PNLC转染效率与阳离子脂质体LipofectamineTM2000相当,而由P12C16（1:6）、单油酸甘油酯和卵磷脂组成的PNLC转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000;由P12C16（1:6）、油酸甘油酯和磷脂DOPE组成的PNLC转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000。PNLC中磷脂为DOPE时的基因转染效率较高。在含有10%血清的条件下,PNLC仍具有较高的基因转染效率。选择由P12C16（1:6）、三油酸甘油酯、DOPE组成的PNLC（PTD）,由P12C16（1:6）、二油酸甘油酯和DOPE组成的PNLC（PDD）,由P12C16（1:6）、单油酸甘油酯和卵磷脂EPC组成的PNLC（PME）,在SPC-A1细胞和CHO细胞中转染虫荧光素酶报告基因pGI3-luc,结果表明在SPC-A1细胞中,三种组成的PNLC的转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000,而且在含有10%血清的条件下具有较高的转染效率;在CHO细胞中,PTD和PDD组成的PNLC的转染效率显著高于阳离子脂质体LipofectamineTM2000,而且在含有10%血清的条件下,均具有较高的转染效率,但是PME组成的PNLC的转染效率非常低。选择PTD、PDD和PME组成的PNLC,以SPC-A1细胞为模型,采用加入特异性抑制剂的方法,考察PNLC/DNA复合物进入细胞的内吞途径以及细胞内的转运机制。分别加入网格蛋白内吞途径抑制剂氯丙嗪和陷穴小泡内吞途径Filipin,测定PNLC/DNA复合物的内吞情况以及虫荧光素酶报告基因在细胞内的表达情况。结果表明在SPC-A1细胞中,加入氯丙嗪后,PNLC/DNA复合物的内吞降低,细胞中表达的luciferase活性降低了近90%,而加入Filipin后,PNLC/DNA复合物的内吞和细胞中表达的luciferase的活性均没有显著性的变化。因此推断PNLC/DNA复合物通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。为了证明这一推断,分别对PNLC/DNA复合物和细胞内溶酶体用荧光探针进行标记,用激光共聚焦显微镜观察发现PNLC/DNA复合物进入细胞后与溶酶体的重合,因此,PNLC/DNA复合物主要是通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。细胞内微管和摩托蛋白对细胞内的膜泡转运具有非常重要的作用,加入微管解聚剂nocodazole和微管稳定剂paclitaxel,动力蛋白抑制剂原钒酸钠（SOV）和驱动蛋白Eg5抑制剂monastrol,测定SPC-A1细胞内表达的luciferase的活性,考察微管和摩托蛋白对于PNLC/DNA复合物在SPC-A1细胞内转运的影响。结果表明SPC-A1细胞中加入微管解聚剂nocodazole和微管稳定剂paclitaxel后,细胞中几乎没有luciferase表达;加入原钒酸钠后细胞中的luciferase的活性提高了50%,加入monastrol后PTD和PDD组成的PNLC转染后luciferase活性降低,而PME组成的PNLC转染后luciferase活性没有显著性变化,同时加入原钒酸钠和monastrol后,细胞内表达的luciferase活性均发生不同程度的降低。这些结果表明,微管和摩托蛋白对于PNLC/DNA复合物在细胞内的转运具有非常重要的影响。为了进一步考察PNLC/DNA复合物进入细胞的过程以及细胞内的转运情况,选择PME组成的PNLC,PNLC用绿色荧光探针FITC标记,质粒DNA用红色荧光探针TM-Rhodamine进行标记,用激光共聚焦显微镜跟踪PNLC/DNA复合物进入细胞以及在细胞内转运的过程。观察结果表明PNLC能够压缩质粒DNA形成PNLC/DNA复合物,内吞进入细胞后,通过早期内吞泡-晚期内吞泡-溶酶体的路径转运到细胞核核周围区域,烷基化聚乙烯亚胺和质粒DNA均可转运进入细胞核。

全文目录


摘要  7-10
Abstract  10-14
前言  14-22
第一章 报告基因的选择及质粒的抽提  22-26
  1.试剂和仪器  22
  2.实验方法  22-24
    2.1.培养基的配制  22-23
    2.2.细菌的复苏、扩增和冻存  23
    2.3.质粒DNA的大量抽提  23-24
    2.4.DNA浓度和纯度的测定  24
  3.试验结果  24-25
    3.1.绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2质粒的提取  24
    3.2.虫荧光素酶报告基因质粒的提取  24-25
  4.小结  25-26
第二章 聚阳离子纳米脂质载体的制备及处方组成的优化  26-78
  2-1 烷基化聚乙烯亚胺的合成及表征  26-29
    1.试剂和仪器  26
    2.试验方法  26-27
    3.试验结果  27-28
    4.讨论  28-29
  2-2 聚阳离子纳米脂质载体制备方法的研究  29-33
    1.试剂和仪器  29
    2.试验方法  29-30
      2.1.聚阳离子纳米脂质载体的处方组成  29
      2.2.聚阳离子纳米脂质载体的制备方法  29-30
      2.3.PNLC制备工艺的优化  30
      2.4.PNLC粒径和Zeta电位的测定  30
    3.试验结果  30-33
      3.1.制备方法对PNLC粒径的影响  30-31
      3.2.乳化溶剂蒸发法制备PNLC制备工艺的优化  31-33
    4.讨论  33
  2-3 聚阳离子纳米脂质载体的处方优化  33-75
    1.试剂和仪器  34
    2.试验方法  34-37
      2.1.聚阳离子纳米脂质载体的处方筛选及优化  34-36
      2.2.PNLC的制备方法  36
      2.3.PNLC粒径和zeta电位的测定  36
      2.4.PNLC/pEGFP-N2复合物的制备  36
      2.5.细胞的培养及体外细胞基因转染试验  36-37
      2.6.SPC-Al细胞表达的绿色荧光蛋白荧光强度的测定  37
    3.试验结果  37-69
      3.1.烷基化聚乙烯亚胺对PNLC的影响  37-53
      3.2.PNLC中油相对PNLC的影响  53-55
      3.3.磷脂成分对PNLC影响  55-69
    4.讨论  69-73
    5.小结  73-75
  参考文献  75-78
第三章 聚阳离子纳米脂质载体作为基因递送载体的研究  78-100
  1.试剂和仪器  78
  2.试验方法  78-81
    2.1.PNLC的处方组成  79
    2.2.复合物的制备及其理化性质的表征  79-80
    2.3.细胞的培养  80
    2.4.细胞的转染  80
    2.5.流式细胞仪评价绿色荧光蛋白报告基因细胞体外转染效率  80
    2.6.虫荧光素酶活性的测定  80-81
    2.7.PNLC细胞毒性的考察结果  81
  3.实验结果  81-94
    3.1.PNLC/DNA复合物理化性质的表征  81-83
    3.2.PNLC转染绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2的研究  83-91
    3.3.PNLC转染虫荧光素酶报告基因pGL3-luc的研究  91-93
    3.4.PNLC载体在SPC-Al细胞中的细胞毒性的研究  93-94
  4.讨论  94-96
  5.小结  96-97
  参考文献  97-100
第四章 聚阳离子纳米脂质载体细胞穿膜机理的研究  100-121
  1.试剂和仪器  100-101
  2.试验方法  101-102
    2.1.PTD、PDD、PMD组成的PNLC的制备  101
    2.2.细胞及细胞培养  101
    2.3.PNLC/DNA复合物的制备以及理化性质的考察  101
    2.4.体外细胞基因转染试验  101
    2.5.FITC标记的P_(12)C_(16)(1:6)的合成以及FITC标记的PNLC载体的制备  101
    2.6.PNLC/DNA复合物在SPC-Al细胞中内吞的研究  101-102
    2.7.PNLC基因递送作用机制的研究  102
    2.8.激光共聚焦显微镜  102
  3.试验结果  102-111
    3.1.PNLC的制备以及PNLC/DNA复合物(N/P)理化性质的表征  102-103
    3.2.PNLC在SPC-Al细胞中内吞途径的研究  103-108
    3.3.微管和摩托蛋白对于PNLC/DNA复合物在细胞内转运的影响  108-110
    3.4.PNLC/DNA复合物与晚期内吞泡/溶酶体的共定位研究  110-111
  4.讨论  111-116
  5.小结  116-117
  参考文献  117-121
第五章 聚阳离子纳米脂质载体转运过程的研究  121-132
  1.试剂与仪器  121
  2.试验方法  121-122
    2.1.PME组成的PNLC的处方组成及制备  121
    2.2.PNLC/DNA复合物的制备及理化性质的表征  121
    2.3.PNLC和质粒DNA的荧光标记  121-122
    2.4.细胞培养以及基因转染  122
    2.5.激光共聚焦显微镜观察  122
  3.试验结果  122-130
    3.1.PNLC/DNA复合物的形态观察  122-123
    3.2.PNLC/DNA复合物的结合形成复合物的情况  123
    3.3.PNLC/DNA复合物在细胞表面的情况  123-125
    3.4.PNLC/DNA复合物在细胞内的运动  125-126
    3.5.PNLC/DNA复合物与溶酶体的定位  126-128
    3.6.PNLC/DNA复合物进入细胞核的观察  128-130
  4.讨论  130
  5.小结  130-131
  参考文献  131-132
全文总结  132-135
在校期间发表论文  135-137
致谢  137-138

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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