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Mechanism of Antibiotic Resistance among Clinical Isolates of Gram Negative Bacteria by Phenotypic and Genotypic Methods

作　者: KISHOR BAJRACHARYA（戈乐斯）
导　师: 李凡
学　校: 吉林大学
专　业: 医学微生物学
关键词: 革兰氏阴性菌 多重耐药 β-内酰胺酶 超广谱β内酰胺酶 金属β内酰胺酶
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究目的：通过耐药表型及基因型研究探讨革兰阴性菌临床分离株的抗生素耐药机制。研究背景：多药耐药病原菌引起的院内感染是住院患者所面临的重要问题。产超广谱B-内酰胺酶(ESBLs)和金属β-内酰胺酶(MBLs)的革兰阴性菌产生速率持续增加,与此同时新型抗菌药物的研发尚未取得任何进展。以往大量检测和治疗产超广谱B-内酰胺酶细菌(如肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌)感染的经验表明,了解这些微生物的生存及传播方式,对于通过靶向经验抗菌药物选择、有效的感染控制进而制定更有效的治疗方案和改善患者预后具有重要意义。在革兰阴性菌中,超广谱B-内酰胺酶和金属B-内酰胺酶的传播直接影响抗菌药物选择。这些耐药决定子使临床医生面临的挑战不容忽视。产ESBLs和MBLS革兰阴性菌使得目前最强大的抗菌药物(如：氧亚氨基头孢菌素和碳青霉烯类)亦面临巨大挑战。B-内酰胺类抗生素因其有效、广谱、低毒是目前世界上最常用的抗生素。然而因其滥用而产生的选择性压力导致了多种B-内酰胺酶突变型的选择和产生,如：ESBLs, Ampcβ-内酰胺酶和MBLs。对这类如此重要的药物产生抗性也为临床工作者带来了越来越复杂的难题。在众多使革兰阴性菌产生B-内酰胺类抗生素抗性的机制中,B-内酰胺酶的产生是迄今为止最为重要的一个因素。伴随着新B-内酰胺类药物的应用,B-内酰胺酶亦不断变化,包括原有B-内酰胺酶流行率增加、新B-内酰胺酶的出现以及该酶表达水平的改变。上述变化与较新的头孢菌素类、单环B-内酰胺类、碳青霉烯类及B-内酰胺酶抑制剂与B-内酰胺的联合制剂的耐药性密切相关。B-内酰胺类抗生素的耐药性还与药物靶点改变、青霉素结合蛋白的产生、以及细菌外膜对药物渗透性的改变有关。对于一些B-内酰胺类药物,尤其是对碳青霉烯类和第四代头孢菌素类的耐药性,在临床相关耐药水平出现前必须获取多种耐药机制。革兰阴性菌临床分离株对B-内酰胺类抗生素的耐药性正在不断上升,只有通过更小心合理的使用才可以使这些药物对感染治疗和预防的有效性得以延续。目标：1、研究多重耐药革兰阴性菌的流行情况和耐药特征。2、明晰革兰阴性菌临床株产超广谱B-内酰胺酶(ESBLs)及金属B-内酰胺酶(MBLs)表型。3、阐明革兰阴性菌临床株携带的主要ESBLs及MBLs基因型。方法：从痰液、尿液、脓汁和其他体液等多种临床样本中分离出136株革兰阴性菌。样本来源于吉林大学中日联谊医院(第三临床医院)不同的科室,如呼吸科、儿科、ICU、整形外科、肾内科、神经外科、肝胆外科、心血管、泌尿外科等,收集时间是从2011年10月到2013年2月。所有的分离株进行细菌培养并鉴定为革兰氏阴性菌。分离出的菌株按照K-B纸片扩散法进行药敏实验,检测其对第三代头孢菌素(氧化亚氨基头孢菌素)和碳青霉烯类等抗生素的耐药性。通过双纸片协同试验(包括CAZ/CAZ+CLA和CTX/CTX+CLA)确认菌株产超广谱B内酰胺酶情况,通过亚胺培南-EDTA双纸片协同法检测菌株产金属B内酰胺酶情况。进一步通过PCR扩增和测序检测超广谱B内酰胺酶产生菌株所携带的ESBLs基因型(如TEM、SHV、CTX-M、PER),以及产金属B内酰胺酶菌株所携带的主要MBLs基因型(如IMP-1、VIM-2)。结果：在分离得到的136株革兰氏阴性菌中,铜绿假单胞菌71株(52.2%)、大肠埃希菌23株(16.9%)、肺炎克雷伯菌14株(10.3%)、鲍曼不动杆菌12株(8.8.%)、产气肠杆菌4株(2.9%)、粘质沙雷菌3株(2.2%)、嗜麦芽窄食单胞菌4株(2.9%)、摩根氏菌2株(1.5%)、奇异变形杆菌3株(2.2%)。研究显示,产ESBLs多重耐药菌在铜绿假单胞菌中比例最高24株(41.4%)、大肠埃希菌12株(20.9%)、肺炎克雷伯菌9株(15.5%)、鲍曼不动杆菌7株(12.3%)、嗜麦芽窄食单胞菌3株(5.2%)、摩根氏菌1株(1.7%)、奇异变形杆菌2株(3.4%)。20株MBLs表型阳性菌株中以鲍曼不动杆菌居多共9株(45%),其次为铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌,各4株(20%),肺炎克雷伯菌2株(10%),大肠埃希菌1株(5%)。所有分离株中呼吸道感染最为常见,占73.5%,其次为泌尿道感染14.7%,导管8.1%,脓汁和其他体液占2.9%,粪便占0.73%。在118株第三代头孢菌素耐药菌株中49.1%(58/118)为产ESBLs株。在35株亚胺培南耐药菌株中57.1%(20/35)为产MBLs株。PCR检测结果显示,blaTEM阳性34.6%(47/136).blaSHV阳性2.9%(4/136)、B1aCTX-lgroup8.1%(11/136).BlaCTX-M-9group阳性8.8%(12/136)。在20株MBLs表型阳性菌株中,VIM-2和IMP-1金属β内酰胺酶基因各检出1株。表型检测中有9株革兰阴性菌显示为ESBLs和MBLs共存。所有菌株中未检出PER-1型ESBLs基因。结论：院内感染革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌分离率较高,且多重耐药状况严重。产超广谱β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶是其对头孢菌素、单环β-内酰胺类以及碳青霉烯类药物耐药的主要原因。菌株所携带的主要耐药基因型为TEM.SHV型广谱β-内酰胺酶,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶,以及VIM-2和IMP-1型金属β内酰胺酶。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-18
Introduction  18-23
Part 1:Literature Review  23-36
  Chapter1.Antibiotic  23-30
    1.1 Definition  23
    1.2 β-lactam antibiotics,its source and classification  23-25
    1.3 β-lactamase inhibitor and its function  25-26
    1.4 Biochemical mechanism of resistance to B-lactam antibiotics  26-27
    1.5 The acquisition and spread of antibiotic resistance in bacteria  27-30
  Chapter2. B-lactamase  30-36
    2.1 β-lactamase enzyme and its origin and classification  30-32
    2.2 Extended spectrum beta lactamase (ESBL) and its types  32-33
    2.3 Metallo-B-lactamases (MBL) and its types  33-36
Part 2:Experimental Study  36-78
  Chapter1. Materials  36-43
    1.1 Bacterial Strains  36-37
    1.2 Main Reagents and Chemicals  37-41
    1.3 Instrument and Equipments  41-43
  Chapter 2.Methods  43-45
    2.1 Isolation and Identification of Gram Negative Bacteria  43
    2.2 Maintenance and preservation of culture strains  43
    2.3 Antibiotic Susceptibility Testing  43-45
  Chapter3. Methods for detection of ESBL and MBL  45-51
    3.1 Detection of ESBL test  45
    3.2 Phenotypic Screening and Confirmatory Test for ESBL  45-46
    3.3 Phenotypic Screening and Confirmatory Test for MBL Test  46-47
    3.4 Genotypic detection of ESBL and MBL  47-51
  Chapter4.Results  51-73
    4.1 Isolation of gram negative bacteria from clinical sample  51-53
    4.2 The resistant rate of the different clinical isolates  53-54
    4.3 The phenotypic detection of ESBLs/MBLs producing strains  54-55
    4.4 The resistant phenotype of β-lactamase(ESBL/MBL)strains  55-58
    4.5 ESBL and MBL genotyping  58-60
    4.6 DNA sequencing results  60-73
  Chapter5.Discussion and Limitation  73-76
  Chapter6.Conclusion  76-78
ACKNOWLEDGEMENTS  78-80
References  80-85
SELF INTRODUCTION  85

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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