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根癌农杆菌介导丝状真菌转化的研究

作　者: 匡小婴
导　师: 诸葛健；饶志明
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD) 3-磷酸甘油酯酶基因(GPP) 电击转化法 PPT抗性根癌农杆菌丝状真菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

重组DNA技术已运用到丝状真菌的研究中,以期获得高产菌株。然而,缺乏有效的转化体系一直制约着丝状真菌基因工程的研究。以获得构建丝状真菌转化系统的筛选标记为目的,从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌,拟从中筛选到抗性基因,为进一步研究农杆菌转化丝状真菌奠定基础。该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2.7 g·L-1。采用常规生理生化鉴定方法,并结合16S rDNA序列分析法对该菌进行鉴定。结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)序列相似性为99.3%,在细菌分类学上属于肠杆菌。将它命名为Enterobacter sp. PPT。采用电击转化方法将双元载体导入根癌农杆菌LBA4404,研究了不同条件对转化率的影响。实验结果表明:细胞浓度为4×108、当电场强度为11 kV·cm-1时,转化率达到最高值,为每微克DNA含9.8×103个转化子;在细胞的OD600约为1.0时进行电转化,转化率可达到最高,为每微克DNA含9.54×103个转化子;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细菌浓度密切相关,转化率随着细菌浓度的上升而上升;质粒大小与电击转化效率之间没有明确的关系。含pCAMBIA3300的根癌农杆菌与丝状真菌共培养转化,在含有PPT的平板上筛选到转化子。PCR扩增转化子的染色体,初步证明Bar基因转入丝状真菌中。研究表明:以Bar基因为转化选择标记和以PPT为选择压是可行的,建立了以Bar基因为抗性选择标记的农杆菌介导丝状真菌的遗传转化平台,为今后丝状真菌的转化奠定了基础。在上述根癌农杆菌介导丝状真菌转化的基础上,首先尝试了将产甘油假丝酵母的产甘油关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glycerol 3-phosphate dehydro-genase GPD)与3-磷酸甘油酯酶基因(glycerol 3-phosphatase GPP)转化到丝状真菌中。因此,分别构建了上下游依次为CaMV35S启动子、GPD基因片断或GPP基因片断和Tnos终止子的的重组表达载体质粒pCAM3300-h-D和pCAM-3300-h-P,在启动子上游含有供选择用的PPT和潮霉素B抗性基因。用含有该重组质粒的根癌农杆菌与几种丝状真菌的菌丝和孢子分别共培养,在含乙酰丁香酮(AS)的条件下,可分别筛选PPT和潮霉素B的抗性转化子。通过PCR扩增证明质粒转入丝状真菌中。将黑曲霉和粗糙脉孢菌的转化子与相应的出发菌株分别进行发酵培养,观察GPD及GPP基因的转入对丝状真菌产甘油的影响。结果发现GPD及GPP基因对丝状真菌产甘油能力的有一定的影响。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一章前言  10-18
  1.1 真菌的遗传转化研究进展  10
  1.2 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的机理  10-11
  1.3 A. TUMEFACIENS TI 质粒载体系统的发展  11-12
    1.3.1 共整合载体系统  11-12
    1.3.2 双元载体系统  12
  1.4 转基因真菌的遗传表达  12-15
    1.4.1 复制型(replicate plasmid)质粒  12-13
    1.4.2 整合型质粒(integrative plasmid)  13-14
    1.4.3 影响转基因表达的主要因素  14-15
    1.4.4 A.tumefaciens 介导转化方法的优点  15
  1.5 BAR 基因的作用机制、特性和研究运用  15-16
  1.6 立题意义和研究内容  16-18
第二章一株降解除草剂膦化麦黄桐菌的筛选与鉴定  18-25
  2.1 材料与方法  18-19
    2.1.1 样品  18
    2.1.2 培养基  18
    2.1.3 生化试剂  18-19
    2.1.4 主要仪器  19
  2.2 实验方法  19
    2.2.1 耐除草剂PPT(膦化麦黄桐)菌株的筛选  19
    2.2.2 细菌生长测定  19
  2.3 菌株的鉴定  19-20
    2.3.1 菌株形态学、生理生化特征  19
    2.3.2 基因组DNA 的提取  19-20
    2.3.3 165 rDNA 的扩增  20
    2.3.4 PCR 扩增条件  20
    2.3.5 PCR 产物的克隆与165 rDNA 序列测定及同源性比较、系统分析  20
  2.4 结果  20-23
    2.4.1 菌种的分离  20
    2.4.2 不同浓度的PPT 对菌株细胞及降解PPT 能力的影响  20-21
    2.4.3 菌种的生理生化鉴定  21-23
  2.5 讨论  23-25
第三章影响根癌农杆菌电击转化条件的研究  25-35
  3.1 引言  25
  3.2 材料与方法  25-29
    3.2.1 培养基  25-26
    3.2.2 主要溶液和缓冲液  26-27
    3.2.3 生化试剂  27
    3.2.4 主要实验仪器设备  27
    3.2.5 菌株与质粒  27-28
    3.2.6 中间双元载体的构建  28
    3.2.7 根癌农杆菌的电击转化  28
    3.2.8 带有双元载体的根癌农杆菌培养  28
    3.2.9 农杆菌质粒DNA 提取方法  28-29
    3.2.10 根癌农杆菌Ti 质粒介导转化  29
    3.2.11 丝状真菌染色体DNA 提取与Bar 基因PCR 扩增  29
  3.3 结果与讨论  29-33
    3.3.1 不同电压对转化率的影响  29-30
    3.3.2 细胞生长时期对转化率的影响  30
    3.3.3 细胞浓度对转化率的影响  30
    3.3.4 质粒的大小对转化效率的影响  30
    3.3.5 转化子质粒的提取和酶切验证  30-31
    3.3.6 含有Bar 基因的丝状真菌的筛选  31-32
    3.3.7 PCR 鉴定  32-33
  3.4 结论  33-35
第四章根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母中的甘油合成关键酶基因GPD、GPP 转化丝状真菌  35-49
  4.1 实验材料  36-37
    4.1.1 菌株与质粒  36
    4.1.2 工具酶和试剂  36
    4.1.3 培养基和试剂  36
    4.1.4 主要仪器和设备  36-37
  4.2 实验方法  37-42
    4.2.1 菌种的培养  37
    4.2.2 丝状真菌孢子的准备  37
    4.2.2 抗生素对菌株生长的影响  37-38
    4.2.3 分别含有GPD、GPP 基因的重组载体质粒的构建  38-39
    4.2.4 根癌农杆菌Ti 质粒介导的丝状真菌的转化方法  39
    4.2.5 丝状真菌染色体DNA 的提取  39-40
    4.2.6 基因扩增  40
    4.2.7 转化子稳定性的检测  40
    4.2.8 发酵试验  40
    4.2.9 甘油含量测定方法  40-42
    4.2.10 残糖测定  42
  4.3 实验结果  42-47
    4.3.1 抗生素对丝状真菌最小抑制浓度测定  42
    4.3.2 带CaMV355 启动子和Tnos 终止子GPD、GPP 基因的中间载体质粒的构建  42-44
    4.3.3 丝状真菌菌丝的共转化及抗性分析  44-45
    4.3.4 PCR 鉴定  45-46
    4.3.5 根癌农杆菌Ti 质粒介导的丝状真菌转化方法的建立  46
    4.3.6 外源基因在转化子的传代中的稳定性  46
    4.3.7 GPD 及 GPP 对丝状真菌发酵的影响  46-47
  4.4 讨论  47-49
论文主要结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-54
硕士研究生期间在科学技术期刊上发表的论文  54

根癌农杆菌介导丝状真菌转化的研究

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