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诱导子对雨生红球藻虾青素含量的影响及其分子机理的初步研究

作　者: 王丽丽
导　师: 龚一富
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis) 虾青素 诱导子 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS) 基因表达
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞绿藻,在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累具有重要价值的次生代谢产物——虾青素。诱导子能促进许多陆地植物细胞次生代谢产物的合成,但诱导子对藻类,特别是雨生红球藻中虾青素含量的影响还未见相关报道。因此本实验研究了不同质量浓度的诱导子甲基茉莉酸（MeJA）、花生四烯酸（AA）和硫酸铈铵（CAS）对雨生红球藻细胞生长和虾青素含量的影响,筛选适合雨生红球藻虾青素积累的最佳诱导子。本研究还采用RT-PCR技术从雨生红球藻中克隆了虾青素生物合成途径的第一个关键酶基因dxs的核心片段,并对其进行了生物信息学分析。通过研究MeJA、AA和CAS诱导条件下的虾青素含量与dxs基因表达量之间的相关性,以求在分子水平上初步阐明雨生红球藻虾青素积累的原因和机理,为虾青素的大规模工厂化生产提供理论基础。研究不同质量浓度诱导子对雨生红球藻细胞生长的影响,结果表明,MeJA和CAS均抑制雨生红球藻细胞的生长,高浓度诱导子对雨生红球藻细胞的生长有强烈的抑制作用。而添加适宜浓度的AA能够促进雨生红球藻细胞的生长,其中,62.5 mg/L的AA处理效果最佳,在培养第18 d时细胞密度达12.661×105 cells/ml,相比对照组（10.290×105 cells/ml）增加23.04%。研究不同质量浓度诱导子对雨生红球藻虾青素含量的影响,结果表明,3种诱导子均能显著促进雨生红球藻单位细胞虾青素的合成。800μmol/L的MeJA处理下,在培养第18 d其单位细胞虾青素含量达1.75×10-4 mg/105cells,相比对照组(1.42×10-4 mg/105cells)增加23.24%;312.5 mg/L的AA处理下,在培养第18 d其单位细胞虾青素含量达2.68×10-4 mg/105cells,相比对照组增加88.73%;2 mg/L的CAS处理下,在培养第18 d其单位细胞虾青素含量达1.46×10-4 mg/105cells,相比对照组增加1.41%。研究不同质量浓度诱导子对雨生红球藻总虾青素产量的影响,结果表明,添加不同质量浓度MeJA和CAS的总虾青素产量均低于对照组,而添加了0.1312.5 mg/L AA的处理则不同程度地提高了雨生红球藻的总虾青素产量。其中,312.5 mg/L的AA处理效果最佳,不仅使细胞完全变红的周期较对照组提前20 d,且总虾青素产量在培养第18 d达2.987 mg/L,相比对照组（1.466 mg/L）增加了103.75%,增产效果非常明显。采用RT-PCR技术从雨生红球藻中克隆得到了虾青素合成的第一个关键酶基因dxs的核心片段,该核心片段长度为827 bp,包括不完整的开放阅读框（ORF）,编码275个氨基酸。DXS蛋白比对结果显示,推导的HpDXS蛋白与其他物种DXS蛋白的同源性达70%90%,其中与莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）DXS蛋白的同源性最高。系统进化树分析表明,按种属间亲缘关系的远近主要分为植物、藻类、细菌3个大分支。其中,雨生红球藻与同属团藻目的莱茵衣藻形成一个独立分支,两者亲缘关系很近。研究不同质量浓度诱导子诱导下雨生红球藻细胞dxs基因的表达水平,结果表明,适宜质量浓度MeJA、AA和CAS能够增强dxs基因的表达水平。其中,800μmol/L MeJA、312.5 mg/L AA和2 mg/L CAS处理条件下,dxs基因的表达水平分别为最强。研究不同质量浓度诱导子作用下的雨生红球藻虾青素含量与dxs基因表达量之间的相关性,结果表明,3种诱导子作用下的雨生红球藻虾青素含量和dxs基因表达量均呈线性相关,其相关系数分别为0.8124、0.9680、0.9666,因此用dxs基因的表达水平可以反映雨生红球藻的虾青素含量,表明dxs基因是雨生红球藻虾青素合成的一个关键酶基因。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 绪论  13-26
  1.1 雨生红球藻  13
  1.2 虾青素  13-20
    1.2.1 虾青素的分子结构  13-14
    1.2.2 虾青素的生物学功能  14-15
    1.2.3 虾青素的应用  15-16
    1.2.4 虾青素生物合成途径  16-17
    1.2.5 虾青素积累的生理机制  17-19
    1.2.6 虾青素积累的分子机制  19-20
  1.3 诱导子在次生代谢产物积累中的作用  20-26
    1.3.1 诱导子的定义及分类  20-21
    1.3.2 MeJA 对次生代谢产物含量的影响  21-23
    1.3.3 AA 对次生代谢产物含量的影响  23
    1.3.4 CAS 对次生代谢产物含量的影响  23-24
    1.3.5 诱导子的作用机理  24-26
2 材料与方法  26-35
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 主要仪器设备  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 菌株、克隆载体与工具酶  27
    2.1.4 实验藻种  27
    2.1.5 培养基  27
  2.2 方法  27-35
    2.2.1 诱导子对雨生红球藻细胞生长和虾青素含量的影响  27-29
    2.2.2 雨生红球藻虾青素合成关键酶基因dxs 的克隆及表达  29-35
3 诱导子对雨生红球藻细胞生长和虾青素含量的影响  35-54
  3.1 雨生红球藻细胞密度—光密度标准曲线  35
  3.2 诱导子对雨生红球藻细胞生长的影响  35-42
    3.2.1 MeJA 对雨生红球藻细胞生长的影响  35-36
    3.2.2 AA 对雨生红球藻细胞生长的影响  36
    3.2.3 CAS 对雨生红球藻细胞生长的影响  36-40
    3.2.4 影响雨生红球藻细胞生长的最佳诱导子的筛选  40-41
    3.2.5 小结  41-42
  3.3 诱导子对雨生红球藻虾青素含量的影响  42-46
    3.3.1 MeJA 对雨生红球藻虾青素含量的影响  42
    3.3.2 AA 对雨生红球藻虾青素含量的影响  42
    3.3.3 CAS 对雨生红球藻虾青素含量的影响  42
    3.3.4 影响雨生红球藻虾青素含量的最佳诱导子的筛选  42-45
    3.3.5 小结  45-46
  3.4 诱导子对雨生红球藻总虾青素产量的影响  46-52
    3.4.1 MeJA 对雨生红球藻总虾青素产量的影响  46
    3.4.2 AA 对雨生红球藻总虾青素产量的影响  46-47
    3.4.3 CAS 对雨生红球藻总虾青素产量的影响  47
    3.4.4 影响雨生红球藻总虾青素产量的最佳诱导子的筛选  47
    3.4.5 小结  47-52
  3.5 讨论  52-54
4 雨生红球藻虾青素合成关键酶基因dxs 核心片段的克隆及表达  54-67
  4.1 雨生红球藻虾青素合成关键酶基因dxs 核心片段的克隆  54-59
    4.1.1 雨生红球藻dxs 基因核心片段的克隆  54
    4.1.2 雨生红球藻dxs 基因核心片段编码的氨基酸序列比对  54-56
    4.1.3 雨生红球藻DXS 蛋白的特征分析  56-57
    4.1.4 雨生红球藻dxs 基因系统进化树分析  57-59
  4.2 诱导子对雨生红球藻dxs 基因表达的影响  59-61
    4.2.1 MeJA 对雨生红球藻dxs 基因表达的影响  59
    4.2.2 AA 对雨生红球藻dxs 基因表达的影响  59-60
    4.2.3 CAS 对雨生红球藻dxs 基因表达的影响  60-61
  4.3 雨生红球藻虾青素含量和dxs 基因表达量的线性关系  61-65
    4.3.1 MeJA 诱导下雨生红球藻虾青素含量和dxs 基因表达量的线性关系.  61-62
    4.3.2 AA 诱导下雨生红球藻虾青素含量和dxs 基因表达量的线性关系  62-64
    4.3.3 CAS 诱导下雨生红球藻虾青素含量和dxs 基因表达量的线性关系  64-65
  4.4 讨论  65-67
结论  67-68
参考文献  68-77
在学研究成果  77-78
致谢  78

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生理学
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