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AKAP13在小鼠卵泡发育中的作用研究

作　者: 邢修业
导　师: 陈子江
学　校: 山东大学
专　业: 妇产科学
关键词: AKAP13 基因敲除胚胎致死颗粒细胞卵泡发育
分类号: R321.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

AKAP13也称作Brx-1, AKAP-Lbc和proto-Lbc,是众多AKAP蛋白家族成员中的一种。它在多个器官和组织中高表达,比如脾,胸腺,外周血白细胞,骨骼肌和睾丸；在胎盘和肺中适度表达；在肝,脑,小肠,结肠和前列腺癌中没有或者最低限度的表达。AKAP13这一组织分布的特点表明,AKAP13基因可能在调节免疫、生殖和肌肉骨骼系统活动中起着重要的作用。AKAP13包含有两个重要的结构域：PKA结合域和GEF结构域。细胞内许多信号通路主要是由PKA介导的。因此AKAP13可能通过与PKA结合将许多信号通路整合起来。AKAP13通过GEF结构域激活小GTP结合蛋白RhoA在许多生理活动中发挥着重要的作用。因为RhoA可以控制细胞的许多生理活动,比如细胞周期进程,基因表达,肌动蛋白的重构和胞质的分裂。此外,有研究报道,cAMP依赖性的PKA介导的信号通路参与了FSHR信号通路的传导。而且现在研究已表明,AKAP13可以增强配体依赖件的雌激素受体α (ERaα)、β (ERβ)和糖皮质激素受体的活性。考虑到AKAP13参与多种激素的信号转导以及在糖蛋白激素受体信号通路传导中可以结合PKA和激活RhoA等G蛋白活性的重要性,以及影响LHR信号通路的传导,我们提出假设,AKAP13可能参与并且会影响小鼠卵泡FSHR信号通路的传导。首先我们对AKAP13在卵巢组织中的表达情况进行了分析。通过对5例正常的人的卵巢组织进行免疫组织化学染色分析,我们发现,AKAP13主要在人的卵巢黄体,成熟卵泡中的颗粒细胞和膜细胞中表达,而在未成熟的卵泡中不表达。通过对原代培养的小鼠卵巢颗粒细胞免疫化学染色和免疫荧光染色发现,AKAP13蛋白在小鼠卵巢颗粒细胞的细胞质中广泛分布,而且沿着细胞骨架分布,这说明AKAP13的作用可能与细胞骨架相关,这和先前的报道也是一致的。然后我们利用小鼠卵巢颗粒细胞原代培养体系,初步研究了AKAP13在成熟小鼠卵巢FSHR (?)言号通路中的作用。研究发现：(1)FSH处理颗粒细胞48h后与0h比较,可以显著诱导LHR和Aromatase的(?)nRNA转录水平表达,差异有统计学意义(p=0.04,p=0.02)。对于AKAP13, FSH处理颗粒细胞48h后与0h比较,差异不显著,没有统计学意义(p=0.06),但是仍然存在一个FSH可以诱导AKAP13mRNA表达的趋势。(2)与对照组比较,用AKAP13siRNA转染颗粒细胞24h后,可以显著降低内源性AKAP13mRNA水平的表达,AKAP13的表达水平为对照组的11%,差异有统计学意义(p=0.001)。降调AKAP13的表达也会降低Aromatase和LHR基础转录水平的表达,差异均有统计学意义(p=0.03,p=0.005。(3)在原代培养成熟小鼠卵巢颗粒细胞中,使用siRNA降调AKAP13的表达后,再给予FSH处理,使得FSH诱导LHR mRNA表达受损。上述结果还在未成熟小鼠卵巢颗粒细胞原代培养实验中,酚红指示剂和胶原蛋白是否对FSH诱导LHR表达等不同条件中得到了验证。为了明确AKAP13在体内的具体作用,通过同源重组基因打靶技术,我们将AKAP13基因的GEF结构域中的关键序列敲除构建了AKAP13基因敲除小鼠模型。AKAP13基因敲除小鼠纯合子胚胎因为心脏发育严重缺陷于E10.5-11天死亡。经过对这些纯合子胚胎研究发现,它们在E9-9.5天之前都是能正常发育的,但是到了E10天以后,与野生型小鼠胚胎比较发现,纯合子胚胎发育迟缓,前脑尺寸减小,颈部区域紧缩以及第一腮弓发育不全。更重要的是,纯合子胚胎的心脏发育异常,表现为心室的扩大和心包积液的产生。对AKAP13基因敲除的纯合子胚胎HE染色发现,小鼠的心肌随着小梁形成的减少而变薄。为了研究小鼠心脏发育停止作用机制,我们首先检测了心脏中一些增殖和凋亡标志物的情况。Ki67增殖抗原的染色强度在野生型和AKAP13基因敲除纯合子小鼠胚胎中并没有显著差异。使用TUNEL在E9-9.5天检测AKAP13基因敲除纯合子胚胎并没有发现细胞凋亡增加的情况,符合胚胎发育停止的情况,但是并不是由于细胞程序性死亡的增加导致的胚胎发育停止。通过对野生型和杂合型胚胎免疫组化染色发现,AKAP13蛋白主要分布在小鼠的前脑,肢芽,第一腮弓和发育中的心脏。我们试图用RT-PCR方法从AKAP13基因敲除纯合子小鼠的胚胎中扩增AKAP13基因,但是未得到扩增产物。这表明突变型基因不能进行转录或突变的mRNA转录物是不稳定的。由于AKAP13基因敲除小鼠胚胎致死,我们只能通过研究AKAP13基因敲除杂合型小鼠来间接分析AKAP13基因在小鼠卵泡发育中的作用机制。为了评估AKAP13基因对于小鼠生殖能力的影响,我们将野生型的雄性C57BL／6小鼠分别与野生型雌性C57BL/6小鼠和AKAP13基因敲除杂合型雌性小鼠进行交配。在共计19窝中,AKAP13基因敲除杂合型雌性小鼠平均产仔率比野生型雌性小鼠少繁殖1.6个幼仔(3.7VS5.3),但是差异没有统计学意义。尽管差异不显著,但是仍然可以说明,AKAP13基因敲除后小鼠的生殖能力是降低的。因此,除了已知的FSH可以诱导LHR表达以外,FSH还可以诱导AKAP13的表达。降调AKAP13不仅会导致LHR和Aromatase基础水平的表达降低,而且也会使得FSH对LHR的诱导表达受损。除此以外,AKAP13基因敲除杂合型小鼠的生殖能力降低,这些都说明AKAP13可能通过作用于FSHR信号通路下游效应分子而参与并影响FSHR信号通路,进而在小鼠卵泡发育中起着至关重要的作用。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
符号说明  12-14
研究背景  14-23
提出假设  23-24
第一部分 AKAP13在卵巢组织中的表达定位  24-34
  前言  24-25
  材料和方法  25-31
  结果  31-33
  讨论  33-34
第二部分 AKAP13在原代培养小鼠卵巢颗粒细胞中的作用研究  34-47
  前言  34-36
  材料和方法  36-43
  结果  43-45
  讨论  45-47
第三部分 AKAP13基因敲除小鼠模型的构建  47-60
  前言  47-49
  材料和方法  49-57
  结果  57-59
  讨论  59-60
结论  60-61
附图  61-73
附表  73-74
参考文献  74-84
致谢  84-85
在读期间发表论文情况  85-86
学位论文评阅及答辩情况表  86-87
英文论文一  87-100
英文论文二  100-110
英文论文三  110-120

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