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8型腺相关病毒所介导的GDNF与产酶基因对6-OHDA损伤帕金森大鼠模型的保护与恢复性研究

作　者: 冯霄
导　师: 于湘晖
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 帕金森病基因治疗 AAV8 GDNF 产酶基因
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)是目前世界上最普遍的神经退行性运动障碍疾病,且随年龄的增加发病率随之增高。病理上,帕金森病患者最主要的特征是黑质致密部的多巴胺能神经元减少,使黑质-纹状体通路中多巴胺(Dopamine, DA)释放减少,造成纹状体DA含量显著降低。帕金森病的病因和发病机制目前尚不清楚。由于帕金森的发病机制的复杂性和多样性,临床上还没有任何一种药物最终可以减缓阻止甚至逆转帕金森病患者中黑质多巴胺能神经元的变性过程,从而恢复黑质纹状体通路的正常功能。无论是药物治疗,手术治疗或者神经细胞移植治疗,都不能对其有根治作用,而且还会带来明显的副作用。由于帕金森病病变主要是黑质多巴胺能神经元的变性导致纹状体内多巴胺水平下降所致,又因为帕金森病患者的脑中病变的部位范围小,因此帕金森病一直是神经系统疾病中进行基因治疗研究的热门病种。本文采用产酶基因和保护基因,使得携带治疗基因的重组病毒载体具备恢复多巴胺和保护受损细胞的功能,对6-OHDA制备的帕金森大鼠模型进行治疗,以期达到最好的治疗效果。首先,选用胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF),其不仅有保护神经细胞免受损伤的功能,又有使受损细胞恢复的能力。其次,选用神经递质-多巴胺产生所必须的三个酶：AADC(芳香族氨基酸脱羧酶)、tTH(截短型酪氨酸羟化酶)、GCHI (GTP环化酶I)。这三个酶是产生多巴胺所必须的,将其导入纹状体神经细胞能够代替受损的黑质纹状体系统产生多巴胺,可以使纹状体发挥正常的功能。因此选用这四种基因,能够从根本上恢复和保护黑质纹状体系统,使得帕金森症状得到缓解或者根治。在基因治疗所选用的病毒载体中,腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是目前最有效也最安全的帕金森基因治疗的载体。目前来自人类的AAV血清型已经发现12种,研究发现作为临床研究和基因治疗研究最广泛的的AAV2对神经组织的侵染率低,且85%的正常人群有针对AAV2的抗体。因此稀有型的AAV逐渐引起人们的注意。本文所采用的AAV8是目前发现的对黑质纹状体系统有最好的侵染性的病毒载体。同时选用了CAG启动子,与一般启动子相比,其具有在中枢神经系统里高效且长期表达的能力。本论文在设计实验中,将作为辅助因子存在的GCHI用IRES连接在截短型TH(能够使得外源调控更加有效)后面,使得tTH能够和GCHI能够一起发挥生成L-Dopa (Dopamine前体)的功能。其次,限于治疗基因的长度,我们分别将GDNF和AADC单独包装,生成了AAV8-CAG-GDNF, AAV8-CAG-AADC和AAV8-CAG-tTH-IRES-GCH I三种8型重组从V病毒。体外实验中,我们用Cos-7细胞验证了产酶基因-AADC,tTH, GCH I的催化功能,与此同时用AAV8-CAG-zsGREEN在胎鼠的原代纹状体细胞中证实了8型AAV病毒对纹状体的良好的侵染效果。接着,我们制备了用6-OHDA制备了帕金森大鼠模型,经条件优化,成功率达到50%。然后将三种重组病毒按照预先设计分组注入模型鼠纹状体,从行为学、免疫组化等方面评价帕金森大鼠的治疗效果。结果表明,与空白组相比,GDNF组、产酶基因组和联合治疗组模型鼠旋转速度在治疗后第四周下降约为24%、39%、47%,证实了联合治疗组比GDNF组和产酶基因组有更好的治疗效果。其次,实验组模型鼠纹状体的冰冻切片和免疫组化显示出重组病毒携带的目的基因具有较好的表达,且侵染区域能达到纹状体的80%。因此本实验设计达到了预期的目的,为后期的帕金森的基因治疗奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
英文缩写词表  12-13
第一章前言  13-26
  1.1 帕金森病简介  13-16
    1.1.1 帕金森病现状  13-14
    1.1.2 帕金森病的致病机理  14-16
  1.2 帕金森疾病的治疗手段  16-18
    1.2.1 药物治疗  16
    1.2.2 手术治疗  16-17
    1.2.3 神经细胞治疗  17-18
  1.3 帕金森病的基因治疗  18-24
    1.3.1 目的基因的选择  18-20
    1.3.2 基因治疗病毒载体  20-23
    1.3.3 启动子选择  23-24
  1.4 动物模型  24-25
  1.5 题依据  25
  1.6 实验设计  25-26
第二章重组AAV质粒的构建与病毒包装  26-42
  2.1 引言  26
  2.2 实验材料  26-29
    2.2.1 实验试剂  26-27
    2.2.2 实验仪器  27
    2.2.3 实验试剂配制方法  27-29
  2.3 实验方法  29-33
    2.3.1 Trizol法提取总RNA  29-30
    2.3.2 逆转录操作  30
    2.3.3 感受态细胞制备  30-31
    2.3.4 转化操作步骤  31-32
    2.3.5 转染细胞  32
    2.3.6 Western Blot  32-33
    2.3.7 重组AAV病毒包装及纯化  33
    2.3.8 病毒基因组提取  33
  2.4 实验结果与讨论  33-41
    2.4.1 AAV8-CAG-GDNF重组载体构建及表达鉴定  34-35
    2.4.2 AAV8-CAG-AADC重组载体构建及表达鉴定  35-36
    2.4.3 AAV8-CAG-tTH-IRES-GCH Ⅰ重组载体构建及表达鉴定  36-38
    2.4.4 检测三种重组病毒的包装效果  38-41
  2.5 本章小结  41-42
第三章体外检测基因表达的蛋白活性  42-51
  3.1 引言  42
  3.2 实验材料  42-43
    3.2.1 实验仪器  42
    3.2.2 实验细胞与试剂  42-43
    3.2.3 溶液配制  43
  3.3 实验方法  43-45
    3.3.1 酶活检测  43
    3.3.2 色谱条件  43-44
    3.3.3 标准品的测定  44
    3.3.4 实验组样品含量测定  44
    3.3.5 纹状体细胞培养  44-45
  3.4 实验结果与分析  45-50
    3.4.1 标准曲线的测定  45-46
    3.4.2 酶活检测结果  46-48
    3.4.3 胎鼠纹状体细胞的培养  48-50
  3.5 本章小结  50-51
第四章帕金森大鼠模型制备与治疗  51-64
  4.1 引言  51
  4.2 实验材料与方法  51-54
    4.2.1 实验材料  51
    4.2.2 实验方法  51-54
  4.3 实验结果与讨论  54-63
    4.3.1 大鼠造模及实验分组  54-55
    4.3.2 AAV8-CAG-zsGREEN病毒对纹状体的侵染  55-56
    4.3.3 病毒注射后模型鼠旋转数据  56-61
    4.3.4 免疫组化  61-63
  4.4 本章小结  63-64
第五章结论  64-66
  5.1 讨论  64-65
  5.2 结论  65-66
参考文献  66-71
作者简介  71-72
致谢  72-73

8型腺相关病毒所介导的GDNF与产酶基因对6-OHDA损伤帕金森大鼠模型的保护与恢复性研究

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