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新型腺相关病毒载体及应用研究

作　者: 董小岩
导　师: 薛京伦
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 腺相关病毒载体 外壳嵌合AAV载体 8型腺相关病毒载体(AAV8) 体内分布 反向感染 AAV载体阵列 Gaussia荧光素酶(Gluc) 小鼠持续HBV模型 miRNA活性谱
分类号: R450
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


腺相关病毒载体在基因治疗基础研究和临床试验中得到越来越多的应用。近年来,多种血清型以及外壳改造的AAV载体的发展更拓宽了其应用价值和范围。本研究第一部分建立了以携带rep和cap基因的重组单纯疱疹病毒作为辅助病毒的、多种血清型AAV载体的生产系统和方法,并成功地制备了携带报告基因的AAV1、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、AAV2/8m1、AAV8等6种重组病毒,用点杂交方法测定了这些病毒的滴度,用SDS-PAGE方法分析了它们的外壳蛋白组成和病毒纯度。这部分研究为AAV病毒在基因治疗等方面的应用提供了新的选择,也是为本文第二、三部分工作做准备。本研究第二部分创建了一种AAV载体“反向感染”阵列(AAV Reverse Infection Array, AAV RI array)方法,即将携带了报告基因或外源基因的rAAV病毒有序排列于96孔细胞培养板中形成一种阵列并晾干保存。该方法的意义在于可以简单方便地实现高通量的体外转导,可用于在体外比较不同血清型AAV对细胞的转导效率、携带生物传感器用于检测细胞miRNA活性谱等方面的研究。为了探索AAV反向感染的可行性,我们首先研究了96孔培养板上每孔AAV病毒的包被量以及加入的细胞数量范围；其次筛选和优化了AAV载体包被于细胞培养板上晾干保存的溶液配方,并评价了培养板上包被的AAV载体的热稳定性。结果显示,用适当的缓冲液可以将AAV病毒包被在细胞培养板上并且晾干而不失去活性,并且可以在4。C长期保存。之后,我们用AAV RI array方法比较了不同血清型或外壳嵌合型AAV载体对多种细胞的转导效率。将表达EGFP基因的6种AAV载体(包括AAV1、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、AAV2/8m、AAV8载体)用AAV RI array方法体外感染16种细胞,其中包括12种贴壁培养的细胞BHK21, HEK293, BEAS-2BS, C2C12, L02, Huh7, HepG2, Hepal-6, L/S-39, CT-26, A549, HeLaS3和4种悬浮培养的细胞U937、K562、SP2/0、A20细胞。结果表明,AAV载体在对体外培养的不同细胞的感染效率有很大差异,BHK21、HEK293、U937、BEAS-2BS细胞的感染效率高,而CT-26, SP2/0、A20和L/S-39对各型AAV载体均不敏感；对于同一种细胞,不同型AAV载体的感染效率明显不同,一般是AAV2》AV1》其它AAV载体；HeLaS3细胞对AAV1的感染效率则高于AAV2；加丁酸钠可以明显提高AAV载体介导的基因表达,尤其是对于AAV2载体的增强效果最显著,其次是AAV1; AAV8载体对体外培养的各种细胞的感染效率都远不如AAV2和AAV1。在上述工作基础上,我们尝试将AAV RI Array方法应用于细胞miRNA活性的检测,建立了一种新的细胞中miRNA活性谱检测方法。构建了一系列由AAV2载体携带的,-niRNA活性检测传感器(Asensor),并利用AAV RI Array方法将其制备成Asensor阵列,并用其检测了A549. Huh7、HEK293、HeLaS3、K562和BEAS-2BS等细胞株中miRNA的活性谱。初步研究结果令人鼓舞,显示了这种方法良好的的可行性和应用潜力。本研究第三部分尝试用AAV8为载体研制HBV小鼠模型。制备了一种携带1.3拷贝HBV (ayw亚型)基因组的重组AAV8病毒]AV8-HBV1.3,经尾静脉注射到3只C57BL/6小鼠体内。一周开始在血液中检测到]HBsAg和HBeAg的表达,并持续至10周均为阳性。其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周为最低)。而HBeAg表达水平则比较稳定持续。10周后处死动物,取血和肝组织进行检测。肝脏组织切片HE染色进行病理分析,未见明显的炎细胞浸润及组织结构异常；免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中HBsAg和HBeAg均为阳性。提取肝组织基因组DNA,用PCR方法检测HBV S基因,结果3只小鼠均为阳性；进一步用荧光定量PCR法试剂盒(深圳匹基公司)检测血清和肝脏组织中的HBV DNA,3只小鼠血清中的HBV DNA拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL;肝脏中分别为5.7×10、2.6×106copies/g肝组织。为了进一步了解所导入的HBV DNA在肝脏内的复制是按AAV病毒复制方式还是按HBV病毒方式进行的,我们在1.3拷贝的HBV非重复区设计了一对特异性PCR引物,对肝脏组织基因组DNA进行扩增。结果提示,肝脏中的确存在HBV病毒的复制方式。之后,我们初步比较了2种不同品系的小鼠(C57BL/6与Balb/c)注射rAAV8-HBV1.3制备HBV动物模型的效果。结果显示,C57BL/6小鼠能持续表达HBsAg和HBeAg 24周以上,而Balb/c小鼠则表现为持续表达HBeAg,但HBsAg仅在前2周阳性,之后转为阴性,同时HBsAb出现阳性。这些结果提示, C57BL/6小鼠比较容易形成对HBV病毒基因表达的耐受；而Balb/c可能更适合制备慢性乙型肝炎模型。本研究为下一步制备慢性乙肝动物模型奠定了良好基础。

全文目录


缩写词  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-12
第一部分 多种血清型AAV载体的制备  12-19
  前言  12-13
  材料和方法  13-16
    1. 实验材料  13-14
      1.1. 6种辅助病毒HSV-RC  13
      1.2. 通用型AAV载体质粒与重组质粒  13-14
      1.3. 细胞株  14
    2. 试剂及耗材  14
    3. 设备  14
    4. 重组AAV制备方法  14-15
    5. AAV病毒载体质量检测  15-16
      5.1. 病毒滴度分析  15
      5.2. 病毒的鉴别和纯度分析  15-16
  结果  16-18
    1. AAV病毒载体的生产和纯化流程  16
    2. AAV病毒的滴度  16-17
    3. rAAV-EGFP病毒的SDS-PAGE分析  17-18
  讨论  18-19
第二部分 AAV载体"反向感染"阵列技术的创建及应用  19-35
  前言  19-20
  材料与方法  20-22
    1. AAV反向感染培养板的制备流程  20
    2. AAV病毒包被液  20
    3. 制备6种rAAV-CMV-EGFP板  20
    4. 检测细胞对AAV病毒感染的敏感性  20-21
    5. 用发光检测仪检测Gluc的活性  21
    6. 用96微孔板荧光检测仪测定Gluc活性  21
    7. 用多标记微孔板检测仪扫描96孔板中细胞EGFP荧光强度  21-22
  结果  22-32
    1. AAV反向感染方法的建立  22-24
      1.1. 96孔板中rAAV病毒的用量  22
      1.2. 每孔加入细胞数对检测的影响  22-23
      1.3. 不同配方溶液包被的AAV病毒活性检测  23
      1.4. 培养板上包被的AAV病毒的热稳定性  23-24
    2. AAV RI Array方法用于不同型AAV病毒的细胞感染谱分析  24-28
      2.1. 6种不同型的AAV病毒及在培养板上排列  24-25
      2.2. 6种rAAV-EGFP感染16种细胞的EGFP荧光扫描数据  25-26
      2.3. 6种rAAV-EGFP感染16种细胞48h荧光扫描图  26-27
      2.4. 荧光显微镜照相与荧光强度扫描值的比较  27-28
      2.5. 丁酸钠对AAV感染BHK21细胞表达EGFP的影响  28
    3. 一种新的细胞中miRNA活性谱检测方法  28-32
      3.1. pAAV2-miRNAsensor质粒结构  28
      3.2. miRNA活性检测流程  28-29
      3.3. 细胞中57种miRNA的活性谱检测  29-32
  讨论  32-34
  小结  34-35
第三部分 rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型  35-51
  前言  35-36
  材料与方法  36-41
    1. 材料  36-37
      1.1. 质粒、细胞株和病毒  36
      1.2. 试剂盒、试剂和耗材  36-37
      1.3. 主要仪器  37
      1.4. 实验动物  37
    2. 方法  37-41
      2.1. pAAV2neo-HBV1.3质粒及rAAV-HBV1.3病毒的细胞实验  37-38
        2.1.1. rAAV-HBV1.3病毒感染细胞及HBsAg和HBeAg检测实验  37
        2.1.2. 质粒pAAV2neo-HBV1.3转染细胞及HBsAg和HBeAg检测实验  37-38
      2.2. 动物实验  38-41
        2.2.1. C57BL/6小鼠注射rAAV8-HBV1.3实验  38-39
        2.2.2. C57BL/6与Balb/c小鼠注射rAAV8-HBV1.3比较  39-41
  结果  41-48
    1. pAAV2neo-HBV1.3质粒及重组AAV-HBV1.3病毒的细胞实验  41-42
      1.1. 重组AAV-HBV1.3病毒感染细胞及HBsAg和HBeAg检测的实验结果  41
      1.2. 质粒pAAV2neo-HBV1.3转染细胞及HBsAg和HBeAg检测的实验结果  41-42
    2. 动物实验结果  42-48
      2.1. C57BL/6小鼠注射rAAV8-HBV1.3实验结果  42-46
        2.1.1. 血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb检测结果  42
        2.1.2. PCR法检测小鼠肝脏及血清中HBV DNA的S基因片段  42-43
        2.1.3. 小鼠肝脏及血清中HBV DNA拷贝数  43
        2.1.4. HBV DNA在肝脏内的复制方式的确定  43-45
        2.1.5. 小鼠肝脏病理分析  45
        2.1.6. 免疫组化检测肝脏HBV抗原  45-46
      2.2. C57BL/6与Balb/c小鼠注射rAAV8-HBV1.3比较  46-48
  讨论  48-50
  小结  50
  结论  50-51
综述  51-67
  参考文献  59-67
发表文章  67-69
致谢  69-70
附录1:Establishment of an AAV Reverse Infection-Based Array  70-76
附录2:高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转染法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型  76-83

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学
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